本試劑盒將Annexin Ⅴ與7-AAD匹配使用,可以將凋亡早期的細胞和晚期的細胞以及死細胞區分開來。壞死細胞可以同時與Annexin V-APC和7-AAD結合顯色,而7-AAD則被排除在活細胞(APC陰性)和早期凋亡細胞(APC陽性)之外。在沒有巨噬細胞的情況下,凋亡的最后階段會像細胞壞死一樣發生整個細胞的解體,從而使凋亡晚期的細胞也同時被APC

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檢測方法：

● 流式細胞儀 ● 熒光顯微鏡 ● 激光共聚焦

樣本類型：

● 懸浮細胞 ● 貼壁細胞

試劑盒以外自備儀器和試劑耗材：

●流式細胞儀/熒光顯微鏡/激光共聚焦 ●離心機 ●移液器 ●PBS或者HBSS

使用方法：

樣品染色：

1、離心收集懸浮細胞。離心機300-500g力,2-8℃,離心時間5分鐘,棄培養基。

【注】：

● 對于貼壁細胞：小心收集細胞培養液到一離心管內備用。用不含EDTA的胰酶消化細胞,至細胞可以被輕輕用移液管或槍頭吹打下來時,加入前面收集的細胞培養液,吹打下所有的貼壁細胞,并輕輕吹散細胞。再次收集到離心管內。

● 貼壁細胞用不含EDTA的胰酶消化后離心,收集細胞。胰酶消化時間不宜過長,以防損傷細胞膜,引起假陽性。

● 檢測貼壁細胞時,胰酶消化前,去掉的上清也要保留,因為可能存在一些掉下來的凋亡細胞,在胰酶消化后,再將這些上清加回去,一起離心后收集檢測,結果更加準確。

● 對于特定的細胞,如果細胞無法完全離心至離心管底,可以適當延長離心時間或稍稍加大離心力。

● 離心轉速根據平時該細胞實驗時的轉速即可。

● 離心后小心吸除上清,可以殘留約50μL左右的液體,以避免吸走細胞。加入約1mL 4℃預冷的PBS,重懸細胞,再次離心沉淀細胞,小心吸除上清。

2、用冷PBS洗滌細胞兩次。(300g-400g,2-8℃,離心時間5分鐘收集細胞)。

3、用100μL 1×Annexin V結合液懸浮細胞,濃度大約為1-5×10⁶cells/mL。

4、在細胞懸浮液中加入5μL Annexin V-APC染色液,輕輕混勻后于2-8℃避光條件下孵育5-10分鐘。

5、加入5μL 7-AAD染色液后輕輕混勻于2-8℃ 避光條件下孵育1-3分鐘。

6、加入400μL PBS或1×Annexin V結合液,輕輕混勻。

7、立即用流式細胞儀檢測。

【注】：

● 染色完成后要盡快上機檢測,因為細胞在Annexin V結合緩沖液中存活時間不會太長。

流式細胞儀分析：

經處理過的細胞此時可以在流式細胞儀上分析。按常規流式凋亡檢測操作即可。

Annexin V-APC的熒光最大激發波長652nm,最大發射波長670nm；7-AAD 熒光最大激發波長550nm,最大發射波長在647nm。

上機檢測前,須用待測細胞制備質控樣本來設定流式細胞儀的熒光補償和設置十字門的范圍：

(I)未轉染GFP等標記的細胞

① 空白管：陰性對照組細胞,沒有染色的細胞。不加Annexin V/APC,7-AAD。用于調節電壓。

② 單染管：有明顯凋亡的細胞,只加Annexin V/APC染色。用于調節補償。

③ 單染管：有明顯凋亡的細胞,只加7-AAD染色。用于調節補償

④ 檢測管：待測的處理細胞,加Annexin V/APC,7-AAD。用空白管和單陽管調節好電壓補償后,獲得所需要的流式數據。

(II)轉染GFP細胞

① 未轉染空白管：未轉染細胞,陰性對照組細胞,沒有染色的細胞。不加Annexin V/APC,7-AAD。用于調節電壓。

② 轉染GFP空白管：轉染GFP的對照組細胞,沒有染色的細胞。不加Annexin V/APC,7-AAD。用于調補償。

③ 未轉染單染管：未轉染且有明顯凋亡的細胞,只加Annexin V/APC染色。用于調節補償。

④ 未轉染單染管：未轉染且有明顯凋亡的細胞,只加7-AAD染色。用于調節補償。

⑤ 檢測管：待測的處理細胞,加Annexin V/APC,7-AAD。用空白管和單陽管調節好電壓補償后,獲得所需要的流式數據。

【注】：

● 具體流式設置按常規方法即可。參照流式細胞儀說明書或咨詢儀器技術支持。

常見問題分析：

實驗過程中Annexin V染不上色或陽性率偏低。

● 確定實驗中的誘導劑是否能產生凋亡。可通過設定確切凋亡誘導效果的陽性藥物對照來排除這一情況。

● 貼壁細胞消化不當。Annexin V跟PS的結合需要Ca²⁺離子,結合液中含有Ca²⁺,

EDTA的消化會影響染色,建議使用無EDTA的胰酶,或者消化后用PBS洗滌干凈。

● 細胞離心用冷PBS 洗滌后,應盡量吸干殘余液體,殘余過多的PBS 中含有磷酸根,會形成磷酸鈣沉淀,影響Annexin V的染色。

● Annexin V結合液瓶蓋要蓋緊密封,長時間暴露于空氣后,空氣中的CO₂進入后形成CaCO₃會產生沉淀,從而減少游離的Ca²⁺,導致實驗的結果不佳。

● 污染其他的緩沖液。如吸取PBS 后不更換Tip頭會導致游離的Ca²⁺的減少,從而導致實驗的結果不佳。

● 陽性細胞的丟失。如果是貼壁細胞,藥物誘導后漂浮的細胞要收集起來合并檢測,這部分細胞往往是凋亡陽性的細胞,丟棄會造成陽性結果偏低。

實驗過程中陽性率偏高。

● 細胞本身活力太差。實驗中發現未經誘導凋亡的對照細胞經染色后AnnexinV+/7-AAD+雙陽性的細胞比例過高,造成這種結果的原因可能是細胞本身活力太差。建議用臺盼藍染色計算細胞的活力,臺盼藍拒染的細胞應大于95%。若活力偏低低,建議重新復蘇細胞,通常剛復蘇的細胞至少要傳代3次

以后才能進行實驗。

● 細胞操作不當。貼壁細胞消化過程中反復劇烈吹打導致細胞膜破壞,使得假陽性偏高。細胞洗滌、重懸等過程過于劇烈導致細胞膜損傷。Annexin V-APC會進入損傷的細胞膜,在細胞膜內部染色。

● 凋亡誘導時間過長。一般情況下誘導幾個小時就可以出現早期凋亡,因此通常不需要處理大于48小時以上,誘導時間過長會使營養物質耗盡,導致細胞狀態差,假陽性結果偏高。

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