本試劑盒是一種利用熒光探針O52進(jìn)行活性氮檢測(cè)的試劑盒。在活性氮存在的條件下，O52探針與活性氮反應(yīng)生成強(qiáng)熒光物質(zhì)O52F，O52F發(fā)出的綠色熒光強(qiáng)度與組織內(nèi)活性氮水平成正比，檢測(cè)O52F的熒光就可以知道組織內(nèi)活性氮的水平。O52F的熒光最大激發(fā)波長(zhǎng)是490nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)是516nm。

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樣本類(lèi)型：

● 新鮮組織

試劑盒以外自備儀器和試劑耗材：

● 熒光分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀 ● 離心機(jī) ● PBS緩沖液/HBSS（無(wú)酚紅） ● 蛋白定量試劑盒

● 熒光測(cè)定專(zhuān)用的黑色96孔板

使用注意事項(xiàng)：

● 螺旋蓋微量管裝的試劑在開(kāi)蓋前請(qǐng)短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體收集至管底，避免開(kāi)蓋時(shí)液體灑落。

● O52染色液為DMSO溶液，冬季氣溫較低時(shí)在室溫時(shí)為凝固狀態(tài)，極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱溶解，吸頭也需要放在培養(yǎng)箱預(yù)熱，否者容易再次凝固在吸頭內(nèi)壁產(chǎn)生損耗。

● 使用前，先將本品取出回溫至室溫，并對(duì)其進(jìn)行簡(jiǎn)短離心使DMSO溶液集中于管底。

● 盡量縮短探針標(biāo)記后到測(cè)定所用的時(shí)間，以減少各種可能的誤差。

使用方法：

試劑準(zhǔn)備：

根據(jù)樣本數(shù)量，用純水將O52探針10倍稀釋，配制成探針工作液。充分混勻，備用。

【注】：

● 不可以一次性將探針全部稀釋。

● 現(xiàn)配現(xiàn)用。

● O52染色液為DMSO溶液，冬季氣溫較低時(shí)在室溫時(shí)為凝固狀態(tài)，極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱溶解，吸頭也需要放在培養(yǎng)箱預(yù)熱，否者容易再次凝固在吸頭內(nèi)壁產(chǎn)生損耗。

● 微量操作時(shí)，注意探針要有效加入稀釋液中，避免沒(méi)有加入。

● 以下步驟使用的探針為此步驟配制好的探針工作液。

樣本處理：

1、剛?cè)〉玫男迈r組織樣本用PBS洗凈。

2、準(zhǔn)確稱(chēng)取50mg或100mg組織樣本，加入500μL-1 mL勻漿緩沖液A，用勻漿機(jī)/勻漿器充分勻漿。。

樣本檢測(cè)：

1、在96孔板中加入190μL勻漿上清液、10μL O52探針，用移液器吹打，使之充分混勻。

【注】：

● 不同樣本的活性氧差異較大，需要根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果調(diào)整探針用量。一般加入2-10μL探針，染色終濃度按試劑盒中探針母液的200-1000倍稀釋?zhuān)?00倍稀釋適合大多數(shù)樣本。

● 如果熒光強(qiáng)度太強(qiáng)，超過(guò)了檢測(cè)儀器的量程，可以減少探針用量。保證所有樣本探針用量一致即可。

● 此步加入的是經(jīng)過(guò)稀釋配制的探針工作液。

● 以酶標(biāo)儀檢測(cè)為例。也可以用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)，根據(jù)所使用儀器決定勻漿液體積和染色容器。。

2、在37℃避光孵育30分鐘。

3、置于酶標(biāo)儀中，后于激發(fā)波長(zhǎng)為488nm、發(fā)射波長(zhǎng)530nm檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

【注】：

● 或使用熒光光度計(jì)等其它熒光檢測(cè)設(shè)備。

● 必須使用熒光檢測(cè)專(zhuān)用的黑色96孔板。

● 如果熒光強(qiáng)度太強(qiáng)，超過(guò)了儀器的檢測(cè)范圍，可以將孵育后的勻漿上清液用純水稀釋后再檢測(cè)。一般稀釋5-50倍。保證所有樣本稀釋倍數(shù)一致即可。

蛋白定量：

1、另取50μL上清勻漿液，用PBS大約稀釋20-30倍。

2、取100μL進(jìn)行蛋白定量，測(cè)定蛋白濃度（mg/mL）。

結(jié)果處理：

以熒光強(qiáng)度（RFU）/蛋白濃度（毫克蛋白）表示組織活性氮強(qiáng)度。

【注】：

● 數(shù)據(jù)與蛋白濃度的單位無(wú)關(guān)。

● 此處以蛋白濃度數(shù)據(jù)作為校正系數(shù)，對(duì)不同樣品進(jìn)行均一化處理。

● 熒光強(qiáng)度強(qiáng)則活性氮（RNS）含量高。

● 可以用實(shí)驗(yàn)中對(duì)照樣本的熒光強(qiáng)度值為基準(zhǔn)，待測(cè)組樣本的熒光強(qiáng)度值占對(duì)照樣本的百分比來(lái)比較活性氮（RNS）程度差異。

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