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價格：電議
所在地：北京
型號：HR0958
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更新時間：2023-03-30
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王欣(女士) （來電時請說是從給覽網看到我的)
試劑盒以外自備試劑和儀器：
● 激光共聚焦/流式細胞儀/熒光顯微鏡/熒光酶標儀或光度計 ● HBSS或HEPES或PBS(pH7.4)
注意事項：
● 螺旋蓋微量試劑管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內壁上的液體收集至管底，避免開蓋時液體灑落。使用前，先將本品取出回溫至室溫，并對其進行簡短離心使DMSO溶液集中于管底。
● P01探針容易受潮，受潮后穩定性較差，注意干燥保存。
● 吸取P01探針母液時要用干燥的新吸頭，不能使用含水的吸頭。
● 未使用完的P01探針母液請擰緊螺旋蓋，避免受潮失效。
● P01探針工作液含水，配置后不可以長期保存，須現配現用。
● 細胞處理需要小心操作,盡量避免人為的損傷細胞。
● 標記的條件因細胞種類而異，根據不同樣本的實際染色結果做相應調整，在每次實驗前，請先根據不同的實驗要求、細胞類型、細胞膜的通透性等進行優化，確定最佳條件。以下方法僅供參考。
● 熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。
● 染色后立即進行分析。
● 可以在染色溶液中加入等體積的20% Pluro
使用方法：
1、染色工作液的配制：
根據樣品數，用探針稀釋液將P01探針10倍稀釋， 然后再用HBSS緩沖液稀釋P01探針溶液20～200倍，配制成P01探針染色工作液。
【注】：
● 推薦該探針加載濃度是試劑盒中探針母液的200～2000倍稀釋，具體的使用濃度需根據實驗要求進行優化。一般起始濃度用1000倍稀釋即可。為了避免過度加載造成細胞毒性，建議在取得有效結果的基礎上盡量使用最低探針濃度。不同的細胞需要的濃度不同。我們在測試中最低用到過20000倍稀釋使用仍然有良好的熒光信號。
● 也可以不用試劑盒提供的探針稀釋液稀釋探針，直接用HBSS緩沖液稀釋，也可以用不含血清的培養基直接稀釋探針。稀釋后工作濃度是試劑盒中探針母液200-2000倍稀釋。
● 不能用含血清的培養基稀釋探針。
● 也可以用以下緩沖液稀釋用于染色，直接將pH 探針加入，終濃度在200-2000 倍稀釋即可。最佳的稀釋液應能兼顧兩方面——染料加載和良好的細胞反應。可能的選擇有：Hank’s BSS 1×+ 20mM HEPES；Hank’s BSS 1× + 20mM HEPES + 1% BSA。
● 優化細胞種板的密度是很有必要的，保證了過夜培養后每孔可以形成密度相似的均一單細胞層。通過適當的調整種板時的密度，細胞可以培養超過一天來達到實驗當天的要求。粘附性弱或生長不規則的細胞最好在用多聚賴氨酸、層黏蛋白或膠原蛋白包被過的多孔板中培養。
2、將P01探針染色工作液加入已處理好的細胞，在37℃孵育30-60分鐘。
【注】：
● 最佳的孵育時間取決于細胞類型。由于熒光染料對細胞是有毒的，所以要嚴格控制孵育時間。45分鐘、37℃是通常對大多數細胞都有效的孵育條件，一般也作為方法摸索時的起始推薦條件。如果孵育30分鐘可以得到一個可接受的熒光信號，建議采用更短時間的孵育條件。
● 關于陰離子交換蛋白抑制劑：一些類型的細胞通過陰離子交換蛋白轉移陰離子至細胞外，這些陰離子包含了P01熒光染料。這樣不僅僅導致了染料加載效果的減弱，同時導致了最終數據結果的誤差；丙磺舒是一種陰離子交換蛋白抑制劑，被加入到加載培養基中后可以增加染料保留在細胞內的比例。已知的一個需要丙磺舒的細胞類型是CHO。盡管丙磺舒可以延緩染料從細胞內被轉移至胞外，但其對細胞來說有一定的毒性，因此染料加載后的孵育時間應盡可能控制在最短時間內。丙磺舒一般不需要使用，有條件則使用。
3、用PBS或HBSS洗滌細胞2-3次。用HBSS重懸細胞.
4、然后用該細胞進行熒光pH檢測。激發波長 488～506nm，發射波長526～536nm。
【注】：
● 熒光強度增加則細胞內pH值增加，熒光強度降低則細胞內pH值下降。
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