北京百奧萊博供應的甲型H1N1/甲型流感病毒雙重熒用于生化實驗研究等領域，甲型H1N1/甲型流感病毒雙重熒是我司眾多優質病毒PCR檢測試劑盒之一，質量堪比同類進口產品，價格非常優惠，目前正熱烈促銷中，恭候您的咨詢訂購。

北京百奧萊博科技有限公司是一家專業的生物試劑銷售公司。公司主要經營血清、抗原、抗體等生物試劑產品，可以為您提供專業的技術服務，以優良的價格、優質的服務、優先的理念，滿足客戶的各方面的需求，與國內多家企業、單位建立了良好的長期合作關系，擁有較好的企業信譽和品牌形象。 主營產品:血清、抗體、抗原、核酸提取、核酸純化等生化試劑

特別提示：包括甲型H1N1/甲型流感病毒雙重熒光PCR檢測試劑盒在內，本公司的所有產品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫療及其他非科研用途！

產品名稱：甲型H1N1/甲型流感病毒雙重熒光PCR檢測試劑盒
產品貨號：SYA166
產品規格：48次/盒

一、簡介
本試劑盒用一對甲型流感病毒特異性引物，一對甲型H1N1特異性引物，分別結合一條特異性熒光探針，用一步法雙重熒光RT-PCR技術對甲型流感病毒RNA、流感H1N1病毒RNA進行體外擴增檢測，用于臨床上對可疑感染者的病原學診斷。本試劑盒中甲型流感病毒的探針報告基團為VIC/HEX/JOE，流感H1N1病毒的探針報告基團為FAM。

二、用途：
本試劑盒適用于檢測各種咽拭子、鼻拭子、泄殖腔拭子、組織樣品等臨床樣品中甲型流感病毒和H1N1亞型流感病毒。可用于甲型流感病毒和H1N1亞型感染的輔助診斷、監測及流行病學調查，其檢測結果僅供參考。

二、試劑盒組成(48T)
組份 數量 規格
甲型流感/H1N1熒光qRT-PCR反應液(IAV-A/H1N1-qRT-PCR MIX) 1管 672μL/管
酶混合物(Enzymes MIX) 1管 48μL/管
無核酸酶水(Nuclease-Free Water) 1管 500μL/管
陰性對照(NTC) 1 管 50μL/管
陽性對照(IAV-A/H1N1-PTC) 1 管 50μL/管

四、儲存條件及有效期：
本試劑盒于-20℃以下保存，有效期為6個月。

五、熒光PCR儀器適用范圍：
ABI7500熒光定量PCR檢測儀。

六、樣品的采集與RNA提取
6.1 樣品的采集
按照相關標準采集。標本短期內可保存于-20℃，長期保存可置-70℃。但不能超過6個月，標本運送應采用0℃冰壺。
6.1.1 血清：用一次性無菌注射器抽取靜脈血2mL，注入無菌的干燥玻璃管，室溫(22-25℃)放置30-60min，血標本可自發完成凝集析出血清，或直接使用水平離心機，3000rpm離心5min，吸取上層血清，轉移至1.5mL滅菌離心管。
6.1.2 血漿：用一次性無菌注射器抽取靜脈血2mL，注入含EDTA2Na(乙二胺四乙酸二鈉)或檸檬酸鈉抗凝劑的玻璃管，立即輕輕顛倒玻璃管混合5-10次，使抗凝劑與靜脈血充分混勻，5-10min后即可分離出血漿，轉移至1.5mL滅菌離心管。
6.1.3 拭子、分泌物等樣品：在裝有拭子或分泌物的離心管中加入500μL PBS或生理鹽水，劇烈振蕩30s。棉拭子盡量擠出液體轉移到無RNA酶污染的離心管中，6000rpm離心20s，取上清備用。
6.1.4 病灶組織樣品：稱取組織約0.1g于研磨器或組織勻漿器中研磨(zuì好置于冰上或加入液氮)，再加1mL生理鹽水研磨至無塊狀物，然后將樣品轉至1.5mL滅菌離心管中，8000rpm離心2min，取上清液于1.5mL滅菌離心管中。
6.2 樣品RNA提取
可采購北京百奧萊博科技有限公司生產的RNA提取試劑盒(過柱法-熒光配套)或其他合適的商業化產品，并按照相應試劑盒說明進行操作。
 注：陽性對照和陰性對照為已經抽提好的核酸(無需提取)，直接取5μL加入到反應體系中即可。由于陽性對照濃度較高，建議zuì后在樣品制備區域加入陽性對照。

七、檢測步驟
7.1 試劑的準備
從試劑盒中取出熒光RT-PCR反應液(IAV-A/H1N1-RT-PCR MIX)、酶混合液(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設所需要的PCR反應管管數為N(N=樣本數+1管陰性對照+1管陽性對照)，每個測試反應體系配制如下表：
試劑 每個反應加入的量 N個反應加入的量
熒光PCR反應液 14μL N×14μL
酶混合液 1 μL N×1 μL
總量 15μL N×15μL
計算好各試劑的使用量，加入一適當體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設定的N個PCR反應管中分別加入15μL，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽性對照(IAV-A/H1N1-PTC)5μL，10000rpm瞬時離心10秒。總體系20μL。
7.2 real time RT-PCR反應條件
將各反應管放入定量PCR儀器的反應槽內。
推薦循環條件:
反轉錄(Reverse Transcription) 1循環 45℃ for 10 min
預變性 1循環 95℃ for 10 min
PCR擴增 40循環 95℃ for 15 sec
60℃ for 45 sec
在60℃延伸時收集熒光信號 報告基團：設置為FAM和VIC(若儀器無VIC通道，可選擇HEX或JOE通道)。其中FAM基團檢測H1N1，VIC/HEX/JOE基團檢測IAV-A，淬滅基團均為None，請勿選擇ROX參比熒光。

八、結果分析
8.1 結果分析條件設定
直接讀取檢測結果。基線和閾值設定原則根據儀器噪聲情況進行調整，以閾值線剛好超過正常陰性樣品擴增曲線的zuì高點為準。
8.2 試驗成立判定
（1） 陰性對照(NTC)：FAM和VIC/HEX/JOE通道全部陰性。
（2） 陽性對照(IAV-A/H1N1-PTC)：FAM和VIC/HEX/JOE通道均有擴增曲線。
（3） 以上條件應同時滿足，否則，此次試驗視為無效。
8.3 結果判定
（1） FAM通道：Ct值≤35 H1N1亞型流感病毒核酸為陽性；Ct值顯示為無的樣本為陰性樣本，表明H1N1亞型流感病毒核酸陰性。Ct值在35-40個循環之間，為灰區，需要進行重復試驗。如果重復擴增曲線為對數擴增曲線，判為樣本陽性，表明H1N1亞型流感病毒核酸陽性；否則判為樣本陰性。
（2） HEX/VIC/JOE通道：Ct值≤35 甲型流感病毒核酸為陽性；Ct值顯示為無的樣本為陰性樣本，表明甲型流感病毒核酸陰性。Ct值在35-40個循環之間，為灰區，需要進行重復試驗。如果重復擴增曲線為對數擴增曲線，判為樣本陽性，表明甲型流感病毒核酸陽性；否則判為樣本陰性。

九、注意事項：
（1） 初次使用前請仔細閱讀說明書。并嚴格按照說明書步驟操作。
（2） 所有使用的離心管zuì好高壓滅菌，而且必須不含RNA酶。
（3） PCR操作應嚴格按照要求分區(試劑配制區、標本處理區、PCR擴增區等)，防止實驗室污染。
（4） 樣本提取、試劑配置、加樣需在不同區的超凈工作臺進行，以免污染。
（5） 試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照衛生部《微生物生物醫學實驗室生物安全通則》進行處理。


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規格：48次/盒
一、簡介
本試劑盒用一對手足口通用型特異性引物，一對手足口EV71型特異性引物，一對手足口CA16型特異性引物，分別結合一條特異性熒光探針，用一步法熒光RT-PCR技術對手足口通用型EV-U RNA、手足口EV71型RNA、手足口CA16型RNA進行體外擴增檢測，用于臨床上對可疑感染者的病原學診斷。本試劑盒中手足口通用型的探針報告基團為CY5，手足口EV71型的探針報告基團為FAM，手足口CA16型的探針報告基團為HEX/VIC/JOE。

二、用途：
本試劑盒適用于檢測各種腦脊液、咽拭子、糞便或肛拭子或皰疹液內的液體等。可用于手足口病病毒感染的輔助診斷、監測及流行病學調查，其檢測結果僅供參考。

三、試劑盒組成：(48T)
組份 數量 規格
EV-U+EV71+CA16熒光反應液(EV-U+EV71+CA16-qRT-PCR MIX) 2管 456μL/管
酶混合物(Enzymes MIX) 1管 48μL/管
陰性對照(NTC) 1管 30μL/管
陽性對照(EV-U+EV71 +CA16-PTC) 1管 30μL/管

四、儲存條件及有效期：
本試劑盒于-20℃以下保存，有效期為9個月。

五、熒光PCR儀器適用范圍：
1ABI系列，Roche系列等熒光定量PCR檢測儀等。

六、病毒RNA提取
6.1 樣品的采集
按照相關標準采集。標本短期內可保存于-20℃，長期保存可置-80℃，但不能超過6個月，標本運送應采用0℃冰壺。
6.1.1 血清：用一次性無菌注射器抽取靜脈血2mL，注入無菌的干燥玻璃管，室溫(22-25℃)放置30-60min，血標本可自發完成凝集析出血清，或直接使用水平離心機，3000rpm離心5min，吸取上層血清，轉移至1.5mL滅菌離心管。
6.1.2 血漿：用一次性無菌注射器抽取靜脈血2mL，注入含EDTA2Na(乙二胺四乙酸二鈉)或檸檬酸鈉抗凝劑的玻璃管，立即輕輕顛倒玻璃管混合5-10次，使抗凝劑與靜脈血充分混勻，5-10min后即可分離出血漿，轉移至1.5mL滅菌離心管。
6.1.3 拭子、分泌物等樣品：在裝有拭子或分泌物的離心管中加入500μL PBS或生理鹽水，劇烈振蕩30s。棉拭子盡量擠出液體轉移到無RNA酶污染的離心管中，6000rpm離心20s，取上清備用。
6.1.4 病灶組織樣品：稱取組織約0.1g于研磨器或組織勻漿器中研磨(zuì好置于冰上或加入液氮)，再加1mL生理鹽水研磨至無塊狀物，然后將樣品轉至1.5mL滅菌離心管中，8000rpm離心2min，取上清液于1.5mL滅菌離心管中。
6.2 樣品RNA提取
可按常規方法提取，也可采用商品化試劑盒提取病毒RNA。
6.2.1 取無RNA酶的1.5 mL Eppendorf離心管，做好標識。
6.2.2 加入600 μL 裂解液，200 μL樣本，200 μL lǜ仿，混勻器上振蕩5 s，4℃ 12000 rpm離心15 min。
6.2.3 吸取步驟6.2.2中的上清液轉移至新的無RNA酶的1.5 mL Eppendorf離心管中(避免吸出中間層)，加入400 μL 異丙醇，顛倒混勻。
6.2.4 4℃ 12000 rpm離心15 min，棄上清；加入600 μL 75％乙醇。
6.2.5 4℃ 12000 rpm離心10 min，棄上清。打開離心管管蓋，室溫干燥5 min-10 min。
6.2.6 加入10μL 無核酸酶水，溶解管底的RNA，5000 rpm離心5 s，-20℃保存。若長期保存需放置-80℃冰箱。
 注：陽性對照和陰性對照為已經抽提好的核酸(無需提取)，直接取5μL加入到反應體系中即可。由于陽性對照濃度較高，建議zuì后在樣品制備區域加入陽性對照。

七、檢測步驟
7.1 試劑的準備
從試劑盒中取出熒光qRT-PCR反應液(EV-U+EV71+CA16-qRT-PCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，室溫融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設所需要的PCR反應管管數為N(N=樣本數+1管陰性對照+1管陽性對照)，每個測試反應體系配制如下表：
試劑 每個反應加入的量 N個反應加入的量
熒光PCR反應液 19μL N×19μL
酶混合物 1 μL N×1 μL
總量 20μL N×20μL
計算好各試劑的使用量，加入一適當體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設定的N個PCR反應管中分別加入20μL，向每管中加入處理后樣品/陰性對照(NTC)/陽性對照(EV-U+EV71+CA16-PTC)5μL，10000rpm瞬時離心10秒。
7.2 qRT-PCR反應條件
將各反應管放入實時熒光PCR儀器的反應槽內。推薦循環條件:
反轉錄(Reverse Transcription) 1循環 50℃ for 10 min
預變性 1循環 95℃ for 3 min
PCR擴增 45循環 95℃ for 5 sec
55℃ for 60 sec
在55℃延伸時收集熒光信號。設置為CY5、FAM和HEX/VIC/JOE。其中CY5基團檢測EV-U，FAM基團檢測EV71，HEX/VIC/JOE基團檢測CA16。
8.1 結果分析條件設定
直接讀取檢測結果。基線和閾值設定原則根據儀器噪聲情況進行調整，以閾值線剛好超過正常陰性樣品擴增曲線的zuì高點為準。
8.2 試驗成立判定
（1） 陰性對照(NTC)：EV-U、FAM和HEX/VIC/JOE通道全部陰性。
（2） 陽性對照(EV-U+EV71+CA16-PTC)：EV-U、FAM和HEX/VIC/JOE通道均有擴增曲線。
（3） 以上條件應同時滿足，否則，此次試驗視為無效。
8.3 結果判定
（1） CY5通道：Ct值≤35手足口通用型病毒核酸為陽性；Ct值顯示為無的樣本為陰性樣本，表明手足口通用型病毒核酸陰性。Ct值在35-40個循環之間，為灰區，需要進行重復試驗。如果重復擴增曲線為對數擴增曲線，判為樣本陽性，表明手足口通用型病毒核酸陽性；否則判為樣本陰性
（2） FAM通道：Ct值≤35 EV71型手足口病病毒核酸為陽性；Ct值顯示為無的樣本為陰性樣本，表明EV71型手足口病病毒核酸陰性。Ct值在35-40個循環之間，為灰區，需要進行重復試驗。如果重復擴增曲線為對數擴增曲線，判為樣本陽性，表明EV71型手足口病病毒核酸陽性；否則判為樣本陰性。
（3） HEX/VIC/JOE通道：Ct值≤35 CA16型手足口病病毒核酸為陽性；Ct值顯示為無的樣本為陰性樣本，表明CA16型手足口病病毒核酸陰性。Ct值在35-40個循環之間，為灰區，需要進行重復試驗。如果重復擴增曲線為對數擴增曲線，判為樣本陽性，表明CA16型手足口病病毒核酸陽性；否則判為樣本陰性。

九、注意事項：
（1） 初次使用前請仔細閱讀說明書。并嚴格按照說明書步驟操作。
（2） 所有使用的離心管zuì好高壓滅菌，而且必須不含RNA酶。
（3） PCR操作應嚴格按照要求分區(試劑配制區、標本處理區、PCR擴增區等)，防止實驗室污染。
（4） 樣本提取、試劑配置、加樣需在不同區的超凈工作臺進行，以免污染。
（5） 試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照衛生部《微生物生物醫學實驗室生物安全通則》進行處理。



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