特別提示:包括線粒體紅色熒光染色試劑盒在內(nèi),本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗,嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途!
產(chǎn)品名稱:線粒體紅色熒光染色試劑盒
產(chǎn)品貨號:HR0450
產(chǎn)品規(guī)格:1000T
M16線粒體染色試劑盒是利用M系列探針進行線粒體特異性染色的試劑盒。本試劑盒中的M16線粒體染色探針為紅色熒光標記的線粒體探針,具有579/599nm的zuì大激發(fā)/發(fā)射波長。本品適合雙標實驗,因其紅色熒光與其他的綠色熒光探針具有良好的分辨率。
M系列探針是一種細胞滲透型的對活細胞中的線粒體體進行選擇性染色的一類熒光染料,該系列探針可以選擇性標記線粒體,包含標記線粒體的弱巰基反應(yīng)性的氯甲基官能團。只需簡單孵育細胞,即可穿過細胞膜并直接聚集在活性線粒體上。可有效標記活細胞。一旦線粒體被染色后,還能根據(jù)后續(xù)實驗的需求進行固定(醛類固定劑如甲醛)和透化(醛類去污劑如Triton X-100),探針依然維持在細胞內(nèi)。
雖然傳統(tǒng)的線粒體熒光探針如TMR和羅丹明123,也能很容易的聚集在功能線粒體上,但是一旦線粒體膜電位喪失即會被洗掉,從而在一些需要細胞進行醛類固定或者包含線粒體能量狀態(tài)影響因子的實驗中,使其應(yīng)用大受限制,而M系列探針不受線粒體膜電位影響。
M系列線粒體探針具有多種顏色可以選擇,可根據(jù)情況對樣品進行多色標記實驗。除了本試劑盒的紅色熒光探針,我公司還可以提供綠色、藍色、橙色等顏色的染色試劑盒。
儲存條件:染料-20℃避光保存;避免反復(fù)凍融;稀釋液2-8℃保存。
有效期:六個月。
※ ※ ※ 使用前請仔細閱讀產(chǎn)品說明書 ※ ※ ※
使用限制:本試劑盒僅供科學(xué)研究使用,不可用于診斷或治療。
產(chǎn)品更新:我公司會更新或升級產(chǎn)品,以優(yōu)化和增強其使用性能,產(chǎn)品說明書會進行相應(yīng)的版本更新。使用產(chǎn)品時,請參照隨產(chǎn)品附帶的說明書,不要參照網(wǎng)上下載的說明書,可能是不同的版本。需要zuì新電子版說明書時可以在收到產(chǎn)品后發(fā)郵件索取。
使用安全:使用時需要合適的實驗室外套,一次性手套。避免皮膚或粘膜與試劑接觸。如果試劑不小心接觸皮膚或眼睛,應(yīng)立即用水沖洗。
注意事項:
● 螺旋蓋微量試劑管裝的試劑在開蓋前請短暫離心,將蓋和管內(nèi)壁上的液體離心至管底,避免開蓋時試劑損失。
● 禁止與其他品牌的試劑混用,否則會影響使用效果。
● 樣品或試劑被細菌或真菌污染或試劑交叉污染可能會導(dǎo)致錯誤的結(jié)果。
● zuì好使用一次性吸頭、管、瓶或玻璃器皿,可重復(fù)使用的玻璃器皿必須在使用前清洗并徹底清除殘留清潔劑。
● 實驗后完成后所有樣品及接觸過的器皿應(yīng)按照規(guī)定程序處理。
試劑盒以外自備試劑和儀器:
● PBS ● HBSS ●離心機 ●熒光顯微鏡/激光共聚焦顯微鏡
使用方法:
使用注意事項:
● M16染色液為DMSO溶液,冬季氣溫較低時在室溫時為凝固狀態(tài),易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱溶解,吸頭也需要放在培養(yǎng)箱預(yù)熱,否者容易再次凝固在吸頭內(nèi)壁產(chǎn)生損耗。
● 使用前,先將本品取出回溫至室溫,并對其進行簡短離心使DMSO溶液集中于管底。
● 細胞處理需要小心操作,盡量避免人為的損傷細胞。
●標記的條件因細胞種類而異,根據(jù)不同樣本的實際染色結(jié)果做相應(yīng)調(diào)整,在每次實驗前,請先根據(jù)不同的實驗要求、細胞類型、細胞的膜通透性等進行優(yōu)化,確定zuì佳條件。以下方法僅供參考。
●染色后立即進行分析。
1.染色工作液配制:
根據(jù)樣本數(shù)量,用染料稀釋液將M16熒光染料100倍稀釋,再用相應(yīng)的培養(yǎng)基或者HBSS緩沖液20-400倍稀釋(對于后續(xù)需要做固定或透化的樣本,20-100倍稀釋),配制成染色工作液。
【注】:
● 也可以直接用相應(yīng)的培養(yǎng)基或HBSS等緩沖液稀釋M16染料母液至所需濃度。
● 建議收到產(chǎn)品后,根據(jù)單次使用量,對母液進行小量分裝,每次使用一管,試劑-20℃避光凍存,一年穩(wěn)定。
● 開始實驗前,使用培養(yǎng)基或HBSS緩沖液稀釋儲存液到需要的工作濃度。工作濃度為根據(jù)不同細胞的預(yù)實驗結(jié)果確定的zuì佳工作濃度,一般染色終濃度2000-40000倍稀釋。
● 為了降低過度加載染料導(dǎo)致的潛在背景和線粒體毒性,在不影響實驗結(jié)果的前提下應(yīng)盡可能低濃度染色。另外,濃度過高也可能造成非特異性染色,對其他細胞結(jié)構(gòu)進行染色。
● 工作液現(xiàn)配現(xiàn)用。
● 為了降低探針加載過度可能引起的假陽性,建議在不影響染色效果的情況下盡量使用低濃度。
2.細胞染色
2.1對于貼壁細胞
1)培養(yǎng)皿/培養(yǎng)板準備細胞樣本。
2)待細胞生長到合適豐度,吸除培養(yǎng)液,加入適量37℃預(yù)熱的含探針工作液。于生長狀態(tài)下孵育15分鐘~45分鐘(具體孵育時間需根據(jù)細胞類型而定,需預(yù)實驗優(yōu)化)。
【注】:
● 也可以將細胞置于培養(yǎng)皿中的蓋玻片上,加入合適培養(yǎng)基,使其爬片生長。
3)利用新鮮培養(yǎng)基替換上述染色液。
【注】:
● 若染色不夠充分,建議增加染料濃度或延長染色時間。
4)熒光顯微鏡(含合適濾片)或流式細胞儀、熒光酶標儀下觀察。zuì大激發(fā)/發(fā)射波長為579 /599nm。或者進行后續(xù)的固定和透化步驟。
2.2對于懸浮細胞
1)離心,吸除上清。
2)利用37℃預(yù)熱的探針工作液重懸細胞,于生長狀態(tài)下孵育30分鐘~2小時(具體時間需根據(jù)細胞類型而定,需預(yù)實驗優(yōu)化)。
3)離心,吸除染色液,加入新鮮培養(yǎng)液重懸細胞。
4)置于熒光鏡下觀察。或流式細胞儀、熒光酶標儀檢測。zuì大激發(fā)/發(fā)射波長為579/599nm。或者進行后續(xù)的固定和透化步驟。
【注】:
●對于懸浮細胞,也可將細胞貼附于經(jīng)細胞粘合劑處理過的蓋玻片上,然后使用類似于貼壁細胞的方法進行染色。
● 如果需要蓋玻片上固定化的細胞,那么可在鋪片前可以先用多聚賴氨酸(poly-D-lysine)包被載玻片或蓋玻片。
● 若染色不夠充分,建議增加染料濃度或延長染色時間。
3.固定和透化:
1)染色結(jié)束后,利用培養(yǎng)液或緩沖液清洗細胞;
2)小心吸走清洗液。換用新鮮配制且預(yù)熱的含2-4%甲醛的緩沖液或培養(yǎng)液進行細胞固定。
3)清洗細胞:吸除固定液,用適當(dāng)緩沖液沖洗細胞數(shù)次。
4)細胞透化(可選):
ICC等實驗需要細胞要做透化,可將已固定的細胞直接加入含有去污劑如TritonX-100的緩沖液中孵育。透化結(jié)束后,用緩沖液清洗細胞即可進行后續(xù)ICC 實驗。一般用含0.2% Triton X-100的PBS育細胞10分鐘可以達到良好的透化效果。還可利用預(yù)冷的丙酮透化5分鐘,之后用PBS清洗細胞。經(jīng)驗證,即使后繼沒有進一步的抗體標記,丙酮透化處理也可降低背景信號。
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