Southern級動物DNAout
發布日期：2013-06-26 瀏覽次數 ：1443
Southern級動物DNAout
產品及特點 本產品用于從動物培養細胞，動物實體組織和抗凝血液（新鮮或冷凍）中提取高分子量的Southern級的基因組DNA。它具有下列特點：
1. 即開即用，本產品足夠5次中量提取（即每次處理0.5g組織），50次微量提取（即每次處理50-100 mg組織），。
2. DNA純凈，OD260/280值在1.8左右；完整性好，長度在100-200 Kb，適用于Southern雜交、基因文庫構建等對DNA長度要求較高的試驗，也可用于PCR和酶切等實驗。
3. 產量高，每克組織DNA產率為500 ug，5×107個培養細胞可以得到200 ug DNA，20 mL新鮮血液可以得到250 ug DNA。足夠多次Southern雜交使用。
規格及成分 成份 編號 5次大紙盒包裝
裂解液 12065 50 mL
蛋白酶K溶液（10mg/mL） 80911 0.5 mL
Tris飽和酚 3191 100 mL
氯仿：異戊醇混和液 100804 100 mL
TE緩沖液 80934 50 mL
使用手冊 1份
運輸及保存 常溫運輸，4℃保存(但蛋白酶K需要低溫運輸，-20℃保存)，有效期一年。
自備試劑 PBS、氯仿、75%乙醇、無水乙醇
使用方法 注意：任何時候都不能劇烈震蕩、過度離心、或過度干燥DNA，否則將發生斷裂、難溶解等現象。
1. 根據材料的不同按下面的方法處理細胞：
a) 貼壁細胞：用橡膠刮子刮下5×107個-5×108個貼壁細胞并轉移到10-15 mL塑料離心管中，1500 g 4℃離心10分鐘收集細胞，用10 mL自備的PBS洗滌細胞2次，后將細胞懸浮于PBS中使細胞的濃度為5×107個/mL。取1 mL加入10 mL裂解液，輕柔顛倒混勻后放37℃水浴一小時。
b) 懸浮細胞：1500 g 4℃離心10分鐘收集5×107個-5×108個細胞，用10 mL自備的PBS洗滌細胞2次，后將細胞懸浮于PBS中使細胞的濃度為5×107個/mL。取1 mL加入10 mL裂解液，輕柔顛倒混勻后放37℃水浴一小時。
c) 實體組織：把0.5 g新鮮的組織樣品（約5×108個細胞）迅速剪切成不超過1立方厘米的小塊放液氮中凍存，取出后放預冷的研缽中加液氮研磨成粉，待液氮揮發后，把組織粉末轉移到10 mL裂解液中，讓細粉在液面緩慢擴散，然后搖晃使組織粉末浸入裂解液中，后將溶液轉移到10-15 mL塑料離心管中，輕柔顛倒混勻后放37℃水浴一小時。注意：實體組織中肝臟和脾臟的DNase活性較高，其DNA易斷裂，故不要選用這兩種材料，而是選用肺臟、肌肉、腎臟等材料。
d) 新鮮血液：1500 g 4℃離心20 mL新鮮抗凝血液（使用ACD抗凝，約含2×107個有核細胞）15分鐘，去掉血漿，用吸管小心吸出淡黃色的一層并轉移到一個新的離心管中，再次離心并取淡黃色層，在淡黃色層中加3 mL裂解液，37℃水浴一小時。
e) 冷凍血液：室溫水浴融化15 mL冷凍血液（使用ACD抗凝，約含1.5×107個有核細胞），加入一倍體積的自備PBS溶液稀釋樣品，3500 g 室溫離心15分鐘，去掉血漿，加入3 mL裂解液，輕柔顛倒混勻后放37℃水浴一小時。
2. 在裂解樣品中加入100 uL蛋白酶K溶液，輕柔顛倒混勻后放50℃水浴3-13小時。期間需要每隔半小時輕柔顛倒數次混勻。
3. 加10 mL的Tris飽和酚，輕柔顛倒10分鐘混勻（混合液將呈乳濁狀）。不要劇烈震蕩，否則DNA將斷裂。
4. 5000 g室溫離心15分鐘，用粗吸管（直徑不小于3 mm）將粘稠的上清（含DNA）轉移到新離心管中。可以將藍搶頭剪斷一截用來轉移上清，下同。也可以將下層有機相吸走。
5. 在上清中加入10 mL 酚：氯仿：異戊醇（25:24:1）混和液，顛倒5分鐘混勻，5000 g室溫離心5分鐘，用粗吸管（直徑不小于3 mm）將粘稠的上清（含DNA）轉移到新離心管中。
6. 在上清中加入0.1倍體積的3M乙酸鈉（pH5.2）和2倍體積的無水乙醇，輕柔顛倒混勻數次即可見絮狀的DNA沉淀出現。在DNA還沒變成白色（表示有SDS等沉淀附集在DNA上）前用玻璃棒或槍頭將DNA挑出。
7. 將DNA浸入6 mL 75%乙醇中30秒，再浸入6 mL 無水乙醇中30秒。
8. 用槍頭將DNA從玻璃棒上掛到一個干凈的10mL或15mL塑料離心管中，室溫放置30-60分鐘讓乙醇揮發，然后加入5-10 TE緩沖液，在DNA沉淀中加入1mL TE，65℃加熱10分鐘以促進DNA溶解和滅活殘留的DNase，然后4℃放置過夜以讓DNA徹底溶解。如果過夜溶解后DNA溶液渾濁，可以850g離心5分鐘，取上清（DNA溶液）。
9. 取1-2uL在0.7%瓊脂糖膠上電泳以檢查DNA的完整性和濃度（需要用濃度確定的lambda DNA/HindIII作為電泳Marker），否則不能用于后續的酶切。也可測OD260和OD280計算產率，但此法不是非常準確。
10. 將DNA稀釋到0.1ug/uL后可立即使用，也可以在4℃放置幾周，但不建議在-20℃或更低的溫度放置（DNA會斷裂）。長期保存溶入乙醇中后放-20℃保存。
三：Southern級DNA的酶切（本試劑盒不提供所需試劑。在酶切高濃度DNA時，酶能否進入DNA內部非常關鍵，所以請嚴格按下面步驟操作）
11. 計算DNA酶切量與拷貝數。1 pg DNA=978 Million bp=0.978Billion bp。人基因組為3Bbp，Southern雜交至少需要10ug。
12. 設置200 uL的酶切反應：加入10 ug DNA，10 uL 10×酶切緩沖液，加水到190 uL，輕柔混勻后4℃放數小時讓DNA松漲，期間混勻幾次。
13. 按5U/ug DNA的比例加入所選擇的內切酶，先在4℃混勻數分鐘，再放到37℃酶切30分鐘。此步有利于酶打開DNA。
14. 按5U/ug DNA的比例再加入所選擇的內切酶，混勻后37℃ 8-12小時（為避免水分蒸發，加100uL石蠟油或在帶熱蓋的PCR儀中進行）。
15. 取2uL酶切物電泳檢測是否酶切完全，如果酶切不完全則需要分析原因。
16. 加20 uL 3M乙酸鈉（pH5.2）和400 uL無水乙醇，混勻后離心10分鐘沉淀DNA，再用1mL 75%乙醇洗滌一次，干甩數秒后吸干上清。
17. 立即加入50 uL TE過夜溶解DNA沉淀。
18. 56℃加熱2-3分以打斷DNA片段黏性末端間的結合，加上樣液后全部上樣到不含EB的、0.7%的瓊脂糖膠上，按小于1V/cm的電壓電泳12小時，結束后EB染色拍照后用于轉膜。注意：需加1ng陽性質粒或標記的lambda/Hind III。如果不立即電泳，可存放于4℃數周。
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