吖啶橙/溴化乙錠(AO/EB)雙熒光染色試劑盒說明書

產品簡介：
細胞凋亡（Apoptosis）的檢測方法有形態學、生物化學、DNA 片段化檢測方法以及TUNEL 等標記片段化 DNA 方法，但從細胞凋亡概念產生的歷史及準確性方面考慮，使用顯微鏡進行的形態學觀察也是很重要的。細胞死亡的檢測可以通過熒光色素染色區分活細胞、 死細胞， 測定細胞代謝活性和形態學觀察。這些方法都是利用細胞凋亡這種情況進行測定的，因而不一定反映實際情況。MTT 法是測定線粒體中特有酶的活性，反映細胞數目的變化，其結果與細胞死亡的數目未必完全一致。

吖啶橙(Acridine Orange, AO)屬于三環雜芳香燃料, 既可以標記 DNA，又可以標記RNA,屬于異染性熒光染料，因此 AO 常用于細胞內 DNA 和 RNA 進行檢測。AO 與核酸結合方式主要有：1、插入性結合，AO 嵌入核酸雙鏈的堿基對之間，這種結合方式主要為 AO與 DNA 的結合，其熒光發射峰為 530nm，激發后呈綠色熒光； 2、靜電吸引，帶正電荷的AO 與單鏈核酸的磷酸根(帶負電荷)產生靜電間的吸引結合，這種結合方式主要為 AO 與RNA 的結合，其熒光發射峰為 640nm，激發后呈紅色熒光，少量結合會 呈桔黃色或桔紅色熒光。因此，吖啶橙嵌合到雙鏈 DNA 分子中顯綠色，與 DNA 單鏈或 RNA 結合時發橙紅色熒光。

溴化乙錠（Ethidium Bromide,EB）嵌合到雙鏈 DNA 或 RNA 的堿基對中，無堿基特異性，發紅色熒光。吖啶橙可透過活細胞膜，EB 不能通過與活細胞膜具有相同通透性的細胞膜。

產品組成：                                                   
試劑(A): AO solution                200ul              4℃ 避光
試劑(B): EB solution                200ul                RT
試劑(C): AO/EB Dilution Buffer       50ml              4℃ 避光
使用說明書 1 份

自備材料：
1、 熒光顯微鏡
2、 PBS
3、 細胞計數板
4、 載玻片、蓋玻片

操作步驟（僅供參考） ：
1、收集細胞，用PBS清洗細胞1次，加入適量的PBS重懸細胞，計數并調節細胞濃度至（0.2~5）*106/ml。
2、 AO/EB 工作液的配制：取試劑(A)、試劑(B)、試劑(C)， 按照試劑(A):試劑(B):試劑(C)=1:1:8 的比例稀釋成 AO/EB 工作液。
3、 每25~50ul細胞懸液中加入AO/EB工作液2ul，混合均勻，孵育5-15min。
4、 取潔凈載玻片，滴加上 5~10ul 細胞懸液，輕輕蓋上蓋玻片。
5、 在熒光顯微鏡 B 域進行觀察。

染色結果：顯綠色熒光的為活細胞；顯橙色熒光的為死細胞。

注意事項：
1、用能通過活細胞膜與 DNA 結合后發藍色熒光的 Hoechst 33342 和只能通過死細胞與
DNA 結合后發紅色熒光的 propidium iodide，PI)對細胞進行 雙染的方法也比較常用。
2、 如有低溫離心機進行離心效果佳。
3、 操作過程中應注意減少試劑(A)、試劑(B)暴露于強光下的時間。
4、 試劑(B)有一定毒性，請小心操作。
5、 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

有效期： 6 個月有效。