中文名稱：Hoechst33258/PI細胞凋亡染色試劑盒
產品規格：100T
分類：細胞染色
用途：流式細胞術檢測細胞凋亡與細胞壞死
注意事項：Hoechst33258是一種熒光染料,可以穿透細胞膜的藍色熒光染料,對細胞的毒性較低。Propidium Iodide簡稱PI,又稱碘化丙啶,對人體有刺激性。Hoechst33258能被活細胞攝取,與DNA結合,在紫外線下呈藍色熒光。PI使死細胞著色產生紅色熒光。在散點圖上結果為：正常細胞呈低藍/紅光,凋亡細胞呈高藍/低紅光,壞死細胞呈低藍/高紅光。
儲存條件：—20℃,避光,12個月

產品簡介：
Hoechst33258/PI細胞凋亡染色試劑盒(Hoechst 33258/PI Apoptotis Assay Kit)是一種采用Hoechst 33258和碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)雙熒光染色方法進行細胞周期與細胞壞死分析的檢測試劑盒。單純的PI染色能夠觀察DNA直方圖上凋亡細胞的亞G1峰，但只能代表G0/G1期發生凋亡，無法觀察S期和G2期發生的細胞凋亡，而且細胞經過固定后無法對活細胞和死細胞進行區分。Hoechst 33258可以穿透細胞膜，進入正常細胞和凋亡細胞與DNA結合，能在紫外線下顯示藍色熒光，而且染色后凋亡細胞熒光會比正常細胞明顯增強。PI不能穿透細胞膜，對于具有完整細胞膜的正常細胞或凋亡細胞不能染色。而對于壞死細胞，其細胞膜的完整性喪失，PI可以穿透細胞膜使壞死細胞著色產生紅色熒光。

Hoechst 33258/PI雙染后，可在流式細胞儀上將正常細胞、凋亡細胞和壞死細胞區別開來。在二元直方圖上，正常細胞對Hoechst33258具有拒染性，呈弱藍色熒光＋弱紅色熒光(Hoechst 33258+/PI+)；凋亡細胞對Hoechst33258具有嗜染性，呈強藍色熒光+弱紅色熒光(Hoechst 33258 /PI+)；壞死細胞對PI具有嗜染性，呈弱藍色熒光＋強紅色熒光。本試劑盒亦可用熒光顯微鏡進行觀察，檢測細胞含量范圍一般為0.1～1×106之間。

自備材料：
胰蛋白酶消化液
流式細胞儀或熒光顯微鏡
PBS
細胞計數板

操作步驟(僅供參考)：
1、細胞樣品的制備：
⑴貼壁細胞：
①小心收集細胞培養液到一個無菌離心管內備用。
②用胰蛋白酶消化細胞至細胞可以被輕輕用移液管或槍頭吹打下來時，加入前面收集的細胞培養液，吹打下所有的貼壁細胞，并輕輕吹散細胞。
③收集上述細胞懸液到離心管內，4℃ 1000g離心3～5min，使細胞沉到管底，小心吸取上清并丟棄，可留大約50μl培養液，以免吸走細胞。
④加入約1ml提前預冷的PBS，重懸細胞，并轉移至1.5ml無菌離心管，4℃ 1000g離心3～5min，使細胞沉到管底。
⑤小心吸取上清并丟棄，可留大約50μl PBS，以免吸走細胞。輕輕彈擊離心管底以適當分散細胞，避免細胞成團。

⑵懸浮細胞：
①4℃ 1000g離心3～5min，使細胞沉到管底，小心吸取上清并丟棄，可留大約50μl培養液，以免吸走細胞。
②加入約1ml提前預冷的PBS，重懸細胞，并轉移至1.5ml無菌離心管，4℃ 1000g離心3～5min，使細胞沉到管底。
③小心吸取上清并丟棄，可留大約50μl PBS，以免吸走細胞，輕輕彈擊離心管底以適當分散細胞，避免細胞成團。

2、配制Cell Stain Buffer工作液：取適量Cell Stain Buffer(2×)與無菌去離子水或蒸餾水等比例混合，即為Cell Stain Buffer工作液，4℃保存備用。

3、重懸細胞：取上述收集好的0.1～1×106細胞，加入0.9ml Cell Stain Buffer工作液，重懸細胞沉淀。

4、Hoechst 33258/PI染色：
⑴一步法：加入5μl Hoechst 33258 Stain和5μl PI Stain，輕輕混勻， 置于冰浴或4℃，孵育20～30min。
⑵兩步法：
①加入5μl Hoechst 33258 Stain，置于37℃水浴，孵育5～15min
②置于冰水中冷卻后，4℃ 1000g離心3～5min，使細胞沉到管底，棄上層染色液。
③加入0.9ml Cell Stain Buffer工作液，重懸細胞沉淀。
④加入5μl PI Stain， 置于冰浴或4℃，孵育20～30min。

5、檢測與分析：用流式細胞儀在激發波長400～500nm檢測藍色熒光，在大于630nm處檢測紅色熒光，同時檢測光散射情況。采用適當分析軟件進行細胞DNA含量分析和光散射分析。如果使用熒光顯微鏡檢測，檢測前4度 1000g離心3～5min沉淀細胞，用PBS洗滌一次，再涂片觀察紅色熒光和藍色熒光。對于貼壁細胞使用熒光顯微鏡檢測，亦可不收集細胞，棄培養液后直接依次按照上述比例加入試劑(A)、試劑(B)、試劑(C)，冰浴或4℃染色20～30min。染色后PBS洗滌一次，再在熒光顯微鏡下觀察。

染色結果：在藍色熒光對紅色熒光的散點圖上，正常細胞呈低藍光/低紅光，凋亡細胞呈高藍光/低紅光，壞死細胞呈低藍光/高紅光。

注意事項：
熒光染料都存在淬滅的問題，建議染色后盡快檢測。
在為了獲得細胞沉淀的離心的過程中，對于特殊細胞，如果細胞沉淀不充分，可以適當提高離心力或延長離心時間。
Heochst 33258與細胞孵育的時間不宜過長，一般控制在20min以內。太長容易引起Heochst 33258的發射光譜由藍光向紅光遷移，導致紅色熒光與蘭色熒光的比例改變。
如果用于組織的細胞周期與細胞凋亡檢測，則必須把組織消化后，制備成單細胞懸液，才可以進行檢測
PI對人體有刺激性，請注意適當防護。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。