真菌RNA提取試劑盒說明書

產品編號：BTN60305

規格：50T/250T

產品及特點：

本產品專門用于從常見的各種真菌和革蘭氏陽性細菌中快速提取總RNA，提取過的真菌包括Candida albican，Saccharomyces cerevisiae，Schizosaccharomyces pombe 和Pichia pastoris、Aspergillus flavus等。

1. RNA 純度高，OD260/280 一般都在2.0 左右，可直接用于RT-PCR、Northern 雜交、microarray hybridization、cDNA 合成等。

2. RNA 產量高，一般在20-70 μg/mL 酵母培養物(約2.0×10⁷個細胞)

3. 操作簡單，整個過程只需要約30 分鐘。

4. zui大處理量為10 mL 酵母。

5. 固體培養基上的真菌菌落也可以直接用于提取。

規格及成分：

保存條件：

常溫運輸，4℃保存，有效期一年。

自備試劑：

氯fang、75%乙醇、RNase-free 水。

使用方法：

1. 將 50 mg 左右的干菌絲(或100 mg 左右的鮮菌絲、或適當數量的真菌菌落或革蘭氏陽性細菌)轉移到1.5 mL 塑料離心管中。如果是液體真菌培養物，則直接將 1-10 mL 液體真菌在1.5 mL 塑料離心管中12000-15000 g 離心 1 分鐘，并棄盡液體培養基（可以分多次離心）。

2. 加入 0.4 mL 溶液A 并充分吹打混勻。如果A 溶液存放時產生沉淀，請置于65℃融化，用前充分搖晃均勻。

3. 加入 0.4 mL 溶液B，劇烈振蕩30 秒。

4. 65℃保溫5 分鐘。

5. 室溫 12000-15000 g 離心3-5 分鐘，轉移上清到一干凈的1.5 mL 塑料離心管中.

6. 再加入0.1 mL 溶液B 和0.1 mL 自備氯fang，振蕩混勻30 秒。

7. 室溫 12000-15000 g 離心3-5 分鐘，轉移上清到一干凈的1.5 mL 塑料離心管中。

8. 加入兩倍體積（約0.8-1mL）的溶液C，充分混勻。

9. 室溫 12000-15000 g 離心離心3-10 分鐘，RNA 將在管底形成沉淀，小心棄上清。

10. 加自備的75%乙醇，振蕩器上振蕩混均30秒。

11. 室溫 12000-15000 g 離心1分鐘。

12. 小心吸棄上清液，注意不要吸棄RNA沉淀。

13. 重復 75%乙醇洗滌步驟一次。

14. 短暫快速離心，用移液槍小心吸棄殘留液（約50μL）。

15. 短暫放1-2 分鐘后加入100 μL 左右的RNA-free 水使RNA 沉淀溶解，可以立即使用或存放于-80℃長期保存。

16. RNA 完整性的電泳檢測：

如果需要做Northern 雜交，強烈建議用戶使用甲醛變性膠進行RNA 電泳，因為非變性膠不能分離所有的RNA 分子（BioTechniques，28：414，2000）。如果是簡單檢測， 可以使用TAE 或百奧萊博的SuperBuffer-2 DNA/RNA 兩用快速電泳液，但文獻報道必須使用變性上樣液（BioTechniques，9:558，1990）。普通DNA 上樣液不含變性劑，也沒經過去RNase 處理，所以zui好不要使用。尤其需要注意的是不要使用TBE 進行RNA 電泳，因為TBE 所含硼酸是研究多糖的經典方法----硼酸絡合法中的關鍵成分，硼酸通過與RNA核糖中的羥基發生絡合反應，形成RNA 分子內或RNA 分子間的絡合復合物，使同樣長度的RNA 具有不同的泳動速度，電泳條帶彌散，同時有大的RNA 絡合復合物遲留在加樣孔中（一般會誤以為是基因組DNA 污染）。RNA 分子內或RNA 分子間的絡合物的形成的多少和比例又與硼酸與RNA 的數量比例有關，而RNA 樣品中污染的其他多糖也會參與此反應，使硼酸對RNA 電泳的影響更復雜，所以TBE 對RNA 電泳的影響沒有規律性和重復性。有的樣品可以使用有的又不行，zui好是避免使用。

17. RNA 產量產率測定：

將5-10 μL RNA 溶于TE 緩沖液中(pH7.5-8.2 之間)檢測其在OD260的光吸收。通過光吸收可以得出RNA 濃度（1 OD260 的RNA=40μg/mL），進而計算出RNA 的產量（濃度X 體積)和產率(RNA 產量/細菌用量)。注意不要將RNA 稀釋在DEPC 水中檢測OD260 和OD280，否則光吸收比在TE 中測得的低10%-15%。

18. RNA 純度測定：

無污染的總RNA 的OD260/OD280 一般在1.8-2.1 之間(具體數值與其堿基組成和溶液成分等多種因素有關)，OD260/OD230 一般在2.0-2.3 之間，如果低于或高于此范圍則分別表示樣品可能有蛋白質或多糖的污染，但一般不影響RT-PCR 等反應。蛋白質污染可以通過酚/氯fang抽提一次然后酒精沉淀去除，DNA 和多糖污染可以分別用我司基因的DNA Erasol 和PS Erasol 去除。

疑難解答：

Q：為何從酵母中提取的總RNA 有3 條小帶？

A：它們分別是70 bp 左右的tRNA, 120 bp 左右的5 S RNA, 160 bp 左右的5.8 S RNA。

Q：上樣孔里的紅色熒光物一定是污染的基因組DNA 嗎？

A：不是。用TAE 或TBE 電泳液和非變性膠電泳RNA 時容易產生此現象，百奧萊博初步研究發現大部分紅色熒光物是變性不充分的單鏈RNA 通過堿基互補或通過硼酸絡合（如果使用TBE 作電泳液的話）形成的復合物，加RNase 處理后，這些紅色熒光物一般會消失。為避免此現象，建議zui好使用甲醛變性膠電泳。如果需要使用非變性膠，也必須在上樣前使RNA/變性。使用百奧萊博優化的上樣變性/染色三用溶液RNAON可以使RNA

在非變性膠上電泳時也有較好分辨率。使用非變性膠時，可以使用TAE或超快電泳液SuperBuffer-2，zui好不要使用TBE 緩沖液，因為TBE 中的硼酸能與RNA 的多羥基形成復合物，RNA 很難形成銳利的條帶。

Q：如何確認和去處除污染的基因組DNA？

A：如果懷疑有DNA 污染，可以用RNase 處理RNA 樣品，然后再電泳。如果上樣孔里的紅色熒光物不消失，則表示是基因組DNA 污染。進一步確認可以使用PCR 擴增法。去除污染的DNA 可以使用非酶的DNA 去除劑DNA Erasol 或RNase-free DNase，由于RNase-free DNase 一般都有殘留的RNase 污染，所以必須嚴格按照廠家提供的使用手冊進行操作。