B載體說明書

產品編號：BTN51104

規格：2μg

產品及特點：

本產品是在百奧萊博克必隆G 載體的基礎上開發的專門用于快速克隆平末端DNA 片段的專用載體,它是由Sma I 酶切克必隆G 載體后經過純化得到的即用型線性載體。跟克必隆G 載體一樣，本產品帶有自殺基因，Sma I 位點位于該基因之中，只有當外源平末端DNA 插入片段插入Sma I 位點,連接后的DNA 轉化的細胞才能生長,所以zui后得到的轉化子幾乎都是含有平末端DNA 插入片段的重組子。

1. 即用性，可以直接用于連接反應，免去繁瑣的酶切，電泳檢測，純化，去磷酸化，再純化等步驟。

2. 具有克必隆-G 載體的所有優點，包括零背景,適用于所有E.Coli 菌株,多拷貝的colEI 型復制起始位點。

3. 率，由于自殺基因的使用有效地減除了載體自身環化對平末端DNA 克隆的影響，自身環化得到的轉化子在有選擇液存在時只占總轉化子的1%-5%。

4. 應用廣泛，可用于克隆酶切產生的平末端DNA，Pfu 酶擴增的PCR片段，cDNA 片段，3'和5'RACE 片段, Taq 酶擴增的PCR 片段(部分為平末端）。

格及成分：

保存條件：

低溫運輸, -20°C保存，有效期兩年。

自備試劑：

1. 外源DNA 片段。如果含又DNA 片段的反應液中不含其他載體DNA（如酶切反應液，PCR 反應液)，可以不需要凝膠回收,滅活酶后即可直接將反應液用于連接反應。PCR 引物5’端一般為OH 基團，zui好在PCR 后用T4 激酶磷酸化，否則連接效率低。

2. 感受態宿主菌。DH5α，DH10B 或HB101 等常用E.coli 菌株。

3. 連接反應試劑。請購買現成試劑盒。

4. 選擇培養基。在倒LB 平板之前隨產品贈送的選擇液和Amp (如果附贈的選擇液含Amp,則不必須額外加Amp)按比例加入到LB 之中,使選擇液終濃度為1×，Amp 終濃度為50 μg/mL(如果附贈的選擇液含Amp,稀釋到1X 后Amp 的終濃度即為50 μg/mL),混勻后倒盤。

使用方法：

1. 連接反應

a. 取新的經過滅菌處理的0.5 ml Eppendorf 管,編號。

b. 將100 ng 載體DNA 轉移到無菌離心管中，加兩倍摩爾量的外源DNA 片段，折合成重量(ng) = (外源DNA 片段bp 數X 100 ng×2)/5330 bp (載體DNA 長度)

c. 加蒸餾水至體積為8 μl，于45℃保溫5 分鐘，使重新退火的粘端解鏈。將混和物冷卻至0℃。平末端DNA 片段的克隆可以省去45℃保溫5 分鐘這一步。

d. 加入10×T4 DNA ligase buffer 1μl, T4 DNA ligase 0.5 μl，混勻后用微量離心機將液體全部甩到管底，于16℃保溫1-24 小時。

e. 同時做只有外源DNA 片段沒有質粒載體的組對照反應。沒有必要做只有質粒載體而無外源DNA 的對照組，因為自身環化的載體不能生長, 能夠生長的轉化子基本上是兩個載體分子相互連接形成的新載體。但在有兩倍于外源DNA 片段存在的情況下,兩個載體分子連接的機率很小。

2. E.coli感受態細胞的轉化

a. 各取每組連接反應液2μl按標準方法轉化E. coli 感受態細胞。

b. 每組連接反應轉化原液取100μl用無菌玻棒均勻涂布于篩選培養基上，37℃下培養半小時以上,直至液體被完全吸收。

克隆位點：