菌落PCR試劑盒2.0說明書

產品編號：BTN50901

規格：50T

產品及特點：

菌落PCR 是篩選重組子的有效方法，可以使質粒鑒定過程從兩天縮短到幾小時。但由于它直接以E.coli 菌落為PCR 而菌落中常常含有未進入細菌的、來源于連接反應的載體DNA 和插入片段，所以十分容易產生假陽性。本產品針對此缺點進行了改良，具有下列特點：

1. 無假陽性率，特殊的溶菌方式能有效降低菌落中未轉化DNA 對PCR的干擾，使假陽性率低于5%，遠低于大部分同類產品。

2. 簡單快速，用戶只需要提供PCR 引物和E.coli 菌落，不需要細菌培養和質粒提取,整個篩選過程從一天縮短到2-3 小時，節約時間和成本。本產品與常用E.coli 菌株和載體兼容。既可小規模篩選，也適用于大規模篩查。

3. 高靈敏度，既可用于高拷貝質粒，也適合于低拷貝質粒。

4. PCR 反應體系中含有惰性電泳染料，反映完成后可直接上樣電泳，不需另加上樣液。

5. 處理過的菌落樣品低溫長期保存后仍能用于PCR 篩查。

6. 高，價格跟質粒提取試劑盒相當，但節約一天時間。

格及成分：

保存條件：

低溫運輸，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：

1. 標記1.5 mL 塑料離心管，除樣品管外，還必須加上陽性和陰性對照管。

在每個管中加入下列成份配制100 μL 溶菌液：

2. 用無菌牙簽或無菌移液槍頭從培養皿上挑取一個菌落或部分菌落，放入溶菌液中，充分震蕩直到菌落徹底分散混勻。為方便回查，zui好在培養皿上給已取樣的菌落做好標記。

3. 重復第2 步直到待篩查菌落全部轉移到相應的離心管中。

4. 在陽性對照管中，加入已知含有待篩選質粒的菌落；如果沒有此菌落，直接進入第6 步，用連接反應液直接作PCR 的陽性對照。

5. 在陰性對照管中，加入已知的不含有待篩選質粒的任何E.coli 菌落(如常見的宿主細菌)，其他處理同第2 步。

6. 將所有離心管置于37℃保溫30 分鐘，然后轉入100℃水浴處理10分鐘。振蕩混勻溶液數秒后10,000 g 離心1 分鐘，轉移上清到一新的離心管中待用。此溶液為樣品DNA 溶液。

7. 標記與第1 步數量相同的PCR 管，每個管中分別加入下列成份并充分混勻：

注意:引物選擇有三種情況，一是選用商品化的能與多克隆位點兩邊順序結合的通用引物(如T7、T3、SP6 等)；二是使用用戶自己合成的能與插入片段結合的引物（如果插入片段是PCR 產物，引物是現成的）；三是組合一種情況和第二種情況的引物。選擇前兩種引物在篩查到重組子后還必須用其他方法（如質粒制備后酶切或使用載體引物/插入片段引物PCR）進一步確定插入方向。選擇第三種引物則可以同時完成重組子篩選和DNA 插入方向確定兩項工作。用戶可以根據自己的具體情況選擇。

8. 將PCR 管放入PCR 儀器中進行擴增，PCR 溫度參數根據引物和模板情況由客戶自己預先確定。

9. PCR 結束后取10 μL 電泳直接進行瓊脂糖電泳分析(注：本試劑盒提供的PCR buffer 中已經含有電泳染料和甘油，故可以直接上樣。）