動(dòng)物RNA提取試劑盒說明書

產(chǎn)品編號(hào)：BTN3070

規(guī)格：100mL/250mL

產(chǎn)品及特點(diǎn)：

本產(chǎn)品是類似于TRIzol、基于異硫氰酸胍/酚/氯fang提取原理的快速總RNA 提取試劑，可用于從各種動(dòng)物組織（包括白細(xì)胞）和部分植物材料中快速提取總RNA。

1. 操作簡(jiǎn)單快速，只要10 分鐘左右，可以全在室溫下進(jìn)行。

2. RNA 質(zhì)量高，OD260/OD280 一般在1.9 左右。一般不含用RT-PCR可以檢測(cè)到的基因組DNA 污染。

3. 適用于大部分實(shí)驗(yàn)材料，如培養(yǎng)細(xì)胞、各種動(dòng)物材料和少數(shù)植物材料。植物RNA的提取zui好使用植物RNA提取試劑盒。

4. 高于進(jìn)口TRIzol 和TRI Reagent等同類產(chǎn)品。

規(guī)格及成分：

保存條件：

常溫運(yùn)輸，4℃保存，有效期一年。

自備試劑：

氯fang、異丙醇、75%乙醇、RNase-free 水。

使用方法：

注意：下面的操作步驟是用1 mL 本產(chǎn)品進(jìn)行的微量提取的，細(xì)胞使用量一定要準(zhǔn)確，不能超過下述用量，否則將超出本產(chǎn)品的裂解能力，RNA 產(chǎn)量將急劇降低。如果樣品量大，請(qǐng)按比例增加各成份的用量。RNA 工作環(huán)境zui好用的固相RNase清除劑（BTN3080）徹底處理。

1. 對(duì)貼壁細(xì)胞（10 平方厘米）：吸盡培養(yǎng)液，加入1 mL 的本產(chǎn)品用槍充分吹打確保細(xì)胞全部裂解，然后將裂解液轉(zhuǎn)移至干凈的1.5 mL 塑料離心管中，進(jìn)入第6 步。

2. 對(duì)懸浮細(xì)胞（五百萬至一千萬個(gè)）：離心收集細(xì)胞，吸盡液體，加入1 mL本產(chǎn)品，用槍充分吹打確保細(xì)胞全部裂解，然后將裂解液轉(zhuǎn)移到干凈的1.5mL 塑料離心管中，進(jìn)入第6 步。

3. 對(duì)新鮮組織（50-100 mg）：將新鮮組織剪切成小塊，放入10 mL 或15mL 塑料離心管中，加入1 mL 的本產(chǎn)品，用Polytron 剪切式勻漿器冰上勻漿30 秒左右，將勻漿液轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL 塑料離心管中，進(jìn)入第6步。注意：對(duì)肝、脾、胰、腎等細(xì)胞分裂十分旺盛的組織（細(xì)胞中含大量正在復(fù)制的DNA），使用量不要超過30-50 mg，否則十分容易產(chǎn)生DNA污染。對(duì)10 mg 以下的組織，zui好加入本公司的微量RNA 助沉劑。

4. 對(duì)RNALOCKER 保存的組織（50-100 mg）：先用紙吸去RNALOCKER 液體后再剪切成小塊，其余操作同第3 步。RNALOCKER 處理后的組織韌性很強(qiáng)，勻漿時(shí)間需要適當(dāng)延長(zhǎng)。

5. 對(duì)液氮中保存的組織（50-100 mg）：在研缽中研磨成粉，加入1 mL 本產(chǎn)品，用槍充分吹打確保細(xì)胞全部裂解，然后將裂解液轉(zhuǎn)移到干凈的1.5mL 塑料離心管中，進(jìn)入第6 步。

6. 在裝有裂解物/勻漿物的1.5 mL 塑料離心管中加入0.2 mL 自備氯fang，振蕩器上充分振蕩混均30 秒。注意：一定要把官底的溶液震蕩起來，否則只是液面的振動(dòng)。

7. 13000-15000 g 室溫離心3 分鐘。

8. 將上清液（約0.6 mL）轉(zhuǎn)移到另一干凈的1.5 mL 塑料離心管中。下層有機(jī)相（藍(lán)色）和中間層含有DNA 和蛋白質(zhì)，避免觸及，否則將產(chǎn)生蛋白質(zhì)和DNA 污染。為保險(xiǎn)起見，可以留下50-100 μL 上清液不取。

9. 對(duì)脂類豐富的組織（如脂肪組織和腦組織），需再重復(fù)氯fang抽提一到兩次以讓氯fang充分去除脂類分子。

10. 在上清液中加入等體積的異丙醇，振蕩器上振蕩30 秒混勻。

11. 13000-15000 g 室溫離心5 分鐘，離心底的側(cè)面將形成RNA 沉淀。如果組織使用量低于10 mg 或需要提高RNA 回收率，可以將離心時(shí)間延長(zhǎng)到20 或30 分鐘。

12. 小心吸棄上清液，注意不要吸棄RNA 沉淀。

13. 在含RNA 沉淀的離心管中加入1mL 75%乙醇，振蕩混勻30 秒。

14. 13000-15000 g 室溫離心1 分鐘。

15. 小心吸棄上清液，注意不要吸棄RNA 沉淀。

16. 重復(fù)第13-15 的洗滌步驟一次（也可以省略）。

17. 短暫快速離心，用移液槍小心吸棄殘留乙醇(約50μL)。注意不要吸棄RNA

沉淀。此步十分重要，否則殘留的乙醇會(huì)影響RNA 的后續(xù)使用。

18. 室溫放1-2 分鐘后立即加入50-100 μL RNase-free 水使RNA沉淀溶解。

千萬不要用真空離心法使RNA 沉淀過于干燥，否則RNA 將變得十分難溶。RNA 樣品可以立即使用或存放于-80℃待用。

注意：由于RNase-free 水沒有主動(dòng)滅活殘留RNase 的功能，而任何方法提取的RNA 都可能有殘留的RNase，所以強(qiáng)烈建議客戶使用本公司推出的具有主動(dòng)滅活殘留RNase 功能的、同時(shí)跟后續(xù)RT-PCR 等反應(yīng)兼容的液相RNase 清除劑（BTN3091）。

附一：RNA 完整性的電泳檢測(cè)（僅供參考，本產(chǎn)品不含相關(guān)試劑）

如果需要做Northern 雜交，強(qiáng)烈建議用戶使用甲醛變性膠進(jìn)行RNA電泳，因?yàn)榉亲冃阅z不能分離所有的RNA 分子（BioTechniques，28：414，2000）。如果是簡(jiǎn)單檢測(cè)，可以使用TAE 緩沖液或超快核酸電泳液進(jìn)行常規(guī)電泳， 但文獻(xiàn)報(bào)道必須使用RNAon這樣的變性上樣液（BioTechniques，9：558，1990）。普通DNA 上樣液不含變性劑，

也沒經(jīng)過去RNase 處理，所以zui好不要使用，否則RNA 容易降解。

動(dòng)物RNA 電泳后應(yīng)該在UV 下呈現(xiàn)三條清晰的rRNA 帶，28S rRNA條帶的熒光強(qiáng)度一般比18S rRNA 條帶的熒光強(qiáng)度強(qiáng)1.5-2.3 倍。如果這兩條rRNA 帶不清晰或比例小于此范圍則表示RNA 有降解（因?yàn)榇蟮腞NA 被酶降解的可能更大）。

跟動(dòng)物一樣，植物果實(shí)和種子的RNA 一般有三條電泳帶，但植物葉片的RNA 有四條或更多rRNA帶，多余的RNA 來源于葉綠體。

如果電泳發(fā)現(xiàn)RNA 樣品中有DNA 污染（一般是使用過多樣品造成），可分別用非酶DNA 清除劑或RNase-free DNase 清除。

附二：RNA 產(chǎn)量和純度測(cè)定（僅供參考，本產(chǎn)品不含相關(guān)試劑）

用pH 在7.5-8.2的TE 緩沖液將5-10μL RNA 稀釋10-20 倍后在OD260和OD260測(cè)光吸收，通過光吸收可以得出RNA 濃度（1 OD260的RNA=40μg/mL），進(jìn)而計(jì)算出RNA 的產(chǎn)量（濃度×體積)和產(chǎn)率(RNA產(chǎn)量/組織用量)。RNA的產(chǎn)率還隨組織的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)和組織的種類不同而不同，一般來說，代謝旺盛的組織(如肝臟和腎臟)RNA的產(chǎn)率高，代謝不旺盛的組織(如肌肉和脂肪組織)RNA的產(chǎn)率低，下面是常見動(dòng)物組織的RNA產(chǎn)率:

肌肉，胎盤和腦組織: 1-2μg RNA/mg 組織

肝，胰和腎組織: 5-10μg RNA/mg 組織

培養(yǎng)細(xì)胞: 5-15μg/10E6 細(xì)胞

RNA的純度通過OD260/OD280 來確定，一般在1.8-2.1之間即算合格。但即使低于此范圍，一般也不會(huì)影響RT-PCR等反應(yīng)。

蛋白質(zhì)污染可以通過酚/氯fang抽提一次然后酒精沉淀去除，多糖污染可以用多糖清除劑去除。