大家經常談起熒光PCR分析參數設置與結果的關系、乙肝低值質控品濃度的選擇及依據，質控品CV值的確定等問題。這些問題多是大家熟悉但并沒有深究，在日常工作中多沒有合理使用，今天和大家討論如下，希望對實驗室的質量提升有所幫助。
    基線起點和終點的選擇
    基線（Baseline）是指在PCR擴增的初數個循環里，熒光信號變化不大，接近一條直線，這樣的直線即為基線。不同熒光PCR試劑盒由于其敏感性不同，基線起點和終點的設置也不同。對于性能的熒光PCR試劑盒，只需要確定基線的終點，即在早PCR擴增曲線起點前一個循環作為終點，起點在終點前間隔一個以上的循環選擇即可，這樣的分析結果是穩定的。由于PCR干擾物質的影響或試劑盒抗干擾性能的差異，有的試劑盒擴增曲線，在S型擴增前出現曲線下陷或曲線上揚的情況。這時需要對該樣本曲線進行個性化分析，或對該樣本重新檢測。基線的選擇常常與其它分析參數具有聯動性，不同PCR擴增儀的基線確定也有不同。
    熒光閾值的選擇
    熒光閾值應設在PCR指數擴增的起始，并高于陰性對照曲線。其數值選擇與試劑盒的性能有關，對熒光強度較高的擴增曲線，閾值的設定不一定非要遵循固定的原則，基線確定后，閾值幾乎可以隨機選擇或直接使用儀器默認的閾值；如果試劑盒的熒光擴增強度較弱，出現核酸含量較低的樣本擴增曲線熒光值較低，這時閾值的選擇對低值樣本的定量結果影響較大（下圖）。因此，針對試劑盒性能不同，實驗室應建立自己的閾值范圍，盡可能保證低值樣本檢測結果的穩定性。
    斜率
    試劑盒的標準曲線一般由4個間隔10倍或100倍梯度濃度的標準品擬合而成。標準品的濃度是由企業參考品或參考品定值溯源而來，標準品的理論檢測值和實際檢測值進行線性擬合，其理論斜率是3.32，但實際工作中，試劑盒的實際斜率經常出現高于3.32或低于3.32的情況。
    主要有以下兩個原因：
    （1）PCR試劑的擴增效率不是（偏高或偏低），通常情況是擴增效率低于，常見的原因是酶的活性不足、引物探針欠合理或反應液非佳條件，導致實際擴增CT值比理論值滯后，這時斜率會大于3.32。
    （2）試劑盒的標準品溯源定值不準確。4個標準品的賦值是按照10倍或100倍的理論值確定，但實際配制濃度存在逐漸偏高或偏低的情況，或標準品在保存過程中出現不均一的降解，出現本來按照10倍稀釋的標準品，實際測定值似乎是按照11倍進行稀釋的情況。當然也存在按照9倍稀釋的斜率。
    在實際工作中，斜率發生偏倚，
    是否需要調整？調整的標準是什么？
    先要判斷斜率偏倚的原因，對準確進行10倍稀釋的核酸或陽性樣本，采用性能確定的試劑盒進行擴增，如果實測標準品的斜率大于3.32，說明試劑盒的擴增效率低于，如果斜率超過3.6，說明試劑盒的質量存在問題，理應換，此時進行斜率調整并不能解決問題。
    如果是因操作誤差或試劑盒標準品降解等因素導致的斜率偏倚，可以參照實驗室的室內質控品進行個別調整，如果斜率能控制在3.20~3.6之間，實際檢測結果的變化不會對臨床報告的準確性產生明顯影響。因操作不當導致斜率偏倚，在結果分析中調整斜率，是十分必要的事情，但要依據明確，不能一概而論全部進行調整。
    斜率低于3.0或高于3.6均導致高濃度和低濃度樣本的報告值發生較大偏斜。因此，使用斜率控制檢測質量，是每個實驗室都應重視的方面。
    擴增效率的計算
    經常我們看到有的PCR擴增儀器有擴增效率的參數，但在實際工作中大多不為人知或去科學使用。我們知道，PCR的原理是指數擴增，每擴增一個循環，核酸的量增加一倍，即呈2的n次方,熒光曲線之間的間距由等式“2的n次方=稀釋倍數”決定。
    這里的n是標準曲線之間的CT值，如果標準曲線之間的稀釋倍數是10倍，那么2的n次方=10，因此n=3.32，即10倍稀釋的PCR擴增效率理論值為間隔3.32個CT值，也是4個標準品形成的斜率值。
    有的PCR擴增儀用百分率表示擴增效率，即每個循環有效擴增模板的百分率，擴增效率%=（E-1）×，理想的擴增效率是：擴增效率（%）=（2-1）×=。
    例如，如果標準品的斜率是3.5，那么E=10的(1/-3.5)次方=1.931, 擴增效率（%）=（1.931-1）×=93.1%，每個循環的終點，擴增子的拷貝數每個循環增加1.931倍，或93.1%的模板被擴增。
    擴增效率的應用
    擴增效率超越90~105%范圍的影響因素有許多，如果擴增效率下降，常見原因是擴增試劑盒里的引物和探針設計不當，導致與模板的匹配效率較低。實驗室經常采用這種方式檢驗所用試劑盒的質量。如果檢測試劑盒標準品的擴增效率超過，很可能是標準品稀釋倍數存在問題，即本應10倍稀釋的標準品，實際進行了不足10倍的稀釋，當然也存在標準品穩定性較差的情況，這都將導致低值樣本的假性升高。
    關于室內質控品的選擇及CV值
    室內質控是評價或發現一個實驗室檢測穩定性的主要方式，質控品可以來自購買商品，也可以自行制作，但都應確定自身穩定性是否良好。稀釋介質決定了質控品的穩定性，這是讓許多企業和實驗室頭疼的問題，其實無論DNA樣本還是RNA樣本，配制一個穩定性良好的介質并不困難。
    還有質控品的數量和濃度的擇，無論是否有文件規定，選擇一個低值樣本進行室內質控是完全科學可行的，因為中、高濃度的室內質控品，尤其是高于試劑盒定量限3個數量級以上的室內質控品，對質量控制幾乎沒有任何意義。
    低值室內質控品的濃度可以根據試劑盒的定量限來確定，對自信度比較高的實驗室，完全可以選擇試劑盒定量限10倍的樣本作為室內質控品，也可以采用定量限20倍的樣本。例如，如果試劑盒的定量限為20IU/mL, 質控品的濃度選擇為200 IU/mL~400 IU/mL。至于CV值，自然應該符合<5%的要求。

                                                                             （本文內容來源于網絡，如有侵權請聯系刪除）