ELISA試劑盒利用血清提取蛋白的方法及如何避免加樣產(chǎn)生氣泡

  進(jìn)口ELISA試劑盒使用血清提取蛋白是從血清中提取的蛋白質(zhì)，適用于食物工業(yè)的食物增加劑和醫(yī)藥制劑。

  通常提取蛋白質(zhì)的辦法是離心分離，除掉血漿，使二價(jià)鐵血紅素酸化，并將其掃除。但是這種辦法產(chǎn)量很低(100毫升血液僅可提取蛋白質(zhì)約10)克。

  為了進(jìn)步蛋白質(zhì)得率，選用新的辦法，即用每分鐘2 500～3000轉(zhuǎn)的速度 在15～30分鐘內(nèi)將血液進(jìn)行離心分離，使醋酸和氯化鈉的混合物(比值為2∶1～4∶1)酸化。在溫度90～110℃下加熱5～15分鐘。冷卻，再增加yi醚。

  制作辦法：

  取經(jīng)過(guò)安穩(wěn)的血液，作離心分離15～30分鐘，每分鐘轉(zhuǎn)速為2 500～3000轉(zhuǎn)。從而獲得固形物，去除血漿，用水使固形物沉渣溶解。置血紅素于培養(yǎng)基中。為了使培養(yǎng)基酸化而使血紅素分子中的二價(jià)鐵血紅素和血球蛋白的結(jié)合體分離 預(yù)先制備好醋酸和氯化鈉的混合物 并將它加熱到90～110℃。混合時(shí)將固形物的溶血產(chǎn)品緩慢地增加到加熱的混合物中。從頭把溫度逐漸地升高到沸點(diǎn)，煮沸5～15分鐘，以便使結(jié)合體徹底分離，接著將混合物逐步冷卻到室溫。

  為了使二價(jià)鐵血紅素溶解并消除，進(jìn)口ELISA試劑盒在混合物中按溶物產(chǎn)品比值2∶1～5∶1增加yi醚。這時(shí)提取出來(lái)的蛋白質(zhì)呈白棉絮狀。將溶液過(guò)濾，再用yi醚清洗。

  100毫升血中提取的蛋白質(zhì)產(chǎn)品相當(dāng)于14.4克。使用這種辦法，每100毫升的血液可進(jìn)步蛋白質(zhì)得率45。

  ELISA試劑盒如何避免加樣產(chǎn)生氣泡呢?

  通常氣泡都是聚集在ELISA試劑盒酶標(biāo)板的孔周?chē)瑢?dǎo)致孔中液體不能與孔壁有效接觸，使孔內(nèi)反應(yīng)不均一。很多說(shuō)明書(shū)、教科書(shū)上也都提到，加樣時(shí)要避免出現(xiàn)氣泡，這到底是什么原因呢?因?yàn)樵谧鰧?shí)驗(yàn)的過(guò)程中，有時(shí)為了打干凈槍頭里面的液體，很容易產(chǎn)生氣泡，是不是這樣對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果會(huì)后什么影響?

  1.通常氣泡都是聚集在酶標(biāo)板的孔周?chē)瑢?dǎo)致孔中液體不能與孔壁有效接觸，使孔內(nèi)反應(yīng)不均一。

  2.包被時(shí)有氣泡的話，將導(dǎo)致包被不完全實(shí)際包被量下降--弱陽(yáng)性甚至假陰性。

  3.封閉時(shí)有氣泡的話，將導(dǎo)致大量未結(jié)合位點(diǎn)的存在，引起非特異性結(jié)合--本底增高，假陽(yáng)性。

  4.加樣時(shí)有氣泡的話，抗原抗體不能有效的結(jié)合--弱陽(yáng)性甚至假陰性。

  5.加二抗時(shí)有氣泡的話，抗原抗體不能有效的結(jié)合--弱陽(yáng)性甚至假陰性(競(jìng)爭(zhēng)法相反----假陽(yáng)性)。

  6.加顯色液時(shí)有氣泡的話---顯色不完全。

  7.加終止液時(shí)有氣泡的話(1、不能完全終止反應(yīng) 2、影響酶標(biāo)儀比色，OD值增高)

  8.洗滌時(shí)有氣泡的話，非特異性結(jié)合物不能完全洗去，做無(wú)用功。

  避免方法：

  1.加樣時(shí)盡量靠近孔底(不要接觸孔底)，用力均勻，不要過(guò)快過(guò)猛。

  2.封閉時(shí)一定要加滿(mǎn)孔。

  3.洗滌時(shí)一定要加滿(mǎn)孔(重要)，氣泡會(huì)浮上來(lái)*終驅(qū)除。手工洗板時(shí)一定要吸干水分并用力拍干。

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