PC12細(xì)胞培養(yǎng)的具體實驗步驟?

  PC12細(xì)胞是大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤分化細(xì)胞株，具神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的一般特征，因其具可傳代特點，廣泛應(yīng)用于神經(jīng)生理和神經(jīng)藥理學(xué)研究。

  1. PC12細(xì)胞有兩種：未分化型和分化型。其中未分化型的PC12細(xì)胞貼壁能力強(qiáng)，傳代時需要胰酶消化，形狀不規(guī)則。分化型PC12細(xì)胞傳代時不需要胰酶，直接可以吹下來，形狀規(guī)則。這兩種細(xì)胞沒有很大的區(qū)別，但我在實驗中發(fā)現(xiàn)，未分化型的PC12細(xì)胞對藥物的敏感性較之分化型的要差一些。

  2. 由于PC12細(xì)胞是一種腫瘤細(xì)胞，在傳代次數(shù)較多后，它的形狀和性狀會發(fā)生改變。這些改變尤見于未分化型PC12細(xì)胞。主要是細(xì)胞形狀變得加不規(guī)則，對藥物的敏感性愈加下降。因此，建議長期用PC12細(xì)胞作實驗的戰(zhàn)友zui好嚴(yán)格控制細(xì)胞的傳代次數(shù)。

  3.在復(fù)蘇細(xì)胞時動作一定要迅速，放入溫水中1～2min后要馬上加入培養(yǎng)液中，培養(yǎng)12～24小時后換一次培養(yǎng)液，這樣不僅可以把DMSO吸掉，而且可以將死亡的細(xì)胞也吸掉。細(xì)胞一天一看即可，經(jīng)常動會有影響。注意過濾后血清的PH值，因為培養(yǎng)液過濾后PH值會有所改變。復(fù)蘇后的換液時間取決于您復(fù)蘇時是否洗滌離心細(xì)胞，去除了凍存液中的DMSO，如果沒有去除DMSO，細(xì)胞培養(yǎng)過夜后就要徹底換液;如果復(fù)蘇時洗滌離心過，可以待傳代時再換液也可。(據(jù)我個人經(jīng)驗，還是復(fù)蘇時去除DMSO，細(xì)胞的生長狀態(tài)好一些)

  4. 狀態(tài)良好的細(xì)胞復(fù)蘇后 4 h即可貼壁，開始增殖，大約2 d即可傳代，接種48h應(yīng)該到了對數(shù)增長期。

  5. 每天觀察一兩次細(xì)胞我不認(rèn)為會對細(xì)胞的生長造成不良影響，不過每次觀察的時間不易過長。

  6. 傳代時我認(rèn)為zui好不要用胰蛋白酶，因為胰蛋白酶對細(xì)胞有破壞作用。我以前用胰蛋白酶消化傳代過PC12, 結(jié)果傳代后的細(xì)胞雖然貼壁，形態(tài)也好，但就是增殖緩慢，所以我現(xiàn)在都是用槍吸取培養(yǎng)液直接吹打，傳代后細(xì)胞增殖迅速，2 d就長滿了(因為長的太快，我只好降低血清濃度，用5%FBS)

  7. 傳代的時機(jī)zui好選在細(xì)胞生長旺盛，占瓶底70%-80%時zui好，如果細(xì)胞長的太滿，細(xì)胞的狀態(tài)會越來越差，zui后大片死亡;這種細(xì)胞傳代后生長也不好;而且長的太滿后，細(xì)胞貼壁牢，難于吹起來，相反，70%-80%時細(xì)胞很容易吹起來。

  8. 如果細(xì)胞貼壁太緊，不得不用胰蛋白酶消化，注意低濃度，段時間，多洗滌。我一般用0.025%的胰蛋白酶，在鏡下觀察細(xì)胞突起收縮，有零星的細(xì)胞漂起就中止，或用肉眼觀察，瓶底呈現(xiàn)薄霧狀的模糊感時就中止，中止一定要徹底，要用含血清的培養(yǎng)液多洗滌離心幾次，確保去除剩余的胰蛋白酶，否則傳代后的細(xì)胞難以生長。

  9. 就培養(yǎng)器皿的選用，我推薦在60mm的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)傳代，，在皿里細(xì)胞生長的快，我想可能是皿比瓶的氣體交換好吧;第二，傳代時吹打方便，不易污染。

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