zui近小編的朋友圈已被各種秀恩愛的刷屏了，寶寶很是苦惱，在這個既溫馨又傷感的節日里，想想自己曾經追過的女生，想想自己曾經。。。，算了，還是想想曾經困擾過自己的轉錄問題吧~RNA-seq已被廣泛應用于基礎研究、臨床診斷和藥物研發等領域，今天小編就為大家整理了一波RNA-seq常見問題解答，給這個開學季的朋友圈來一點不一樣的.

樣本制備注意事項有哪些？

 

1.細胞類樣本送樣注意事項

 

細胞系樣本培養過程中常會出現支原體污染，將直接影響細胞生長狀態。對于去rRNA鏈特異性文庫，因去rRNA試劑盒具有物種、組織部位特異性，針對真核生物的去rRNA試劑盒無法去除支原體rRNA，會嚴重影響數據質量以及有效數據比例，對分析結果的準確度產生干擾。

 

建議細胞類樣本在測序前，先使用一步法支原體檢測試劑盒或qPCR技術進行支原體檢測，從源頭有效避免支原體污染。

 

2.對于植物、動物、酵母等來源的RNA，一般推薦用哪種方法進行提取

 

RNA提取質量的好壞主要取決于樣品本身的新鮮程度和多糖多酚、次生代謝物的含量；針對大多數的動植物組織樣品，Trizol試劑都能獲得較好的提取效果；對于多糖含量特別豐富的植物組織，如棉花根、樺樹根、蘭花等，可采用天根多糖多酚試劑盒提??；對于脂肪組織，可采用QIAGEN的RNeasy lipidmini kit 進行提取。

 

樣本檢測時需要達到什么要求才認為樣品合格

 

樣本檢測主要關注的指標為總量、RIN值、OD260/280以及28S/18S（原核生物為23S/16S）。其中RIN值及28S/18S是評估RNA完整性的主要指標，RIN值越高，28S/18S越接近2表明完整性越好。一般RIN值大于6.5可嘗試建庫，RIN值過低會影響分析結果的準確度。但對于一些特殊樣品，比如某些昆蟲和水產動物，沒有28S條帶，就不能參考RIN值，一般只要18S前基線平穩可認為樣品合格。

 

生物學重復應該如何來設定
 

1.區分生物學重復與技術重復

 

生物學重復：指樣本重復，不同生物樣本做同樣實驗；

技術重復：一般是對一個生物樣本的實驗指標測定多次。

 

如下圖：對照組A、B、C三只小鼠（control A，B and C）互為生物學重復。實驗組A、B、C三只小鼠（Treated A）同樣互為生物學重復。任一小鼠在板A、B、C中被重復測量了三次，即技術重復了三次。

 

 

2.生物學重復設置幾個合適

 

一般推薦生物學重復≥3，動物或人的個體差異比較大，建議至少做5-10個重復。

 

3.生物學重復取樣要求

 

植物取樣：所取試驗田，長勢，外部形態特征相同；

動物取樣：遺傳背景，飼養條件，年齡，性別，外部形態特征相同；

混合取樣：保證混合樣品處理方式，處于發育階段，個體外部形態特征相同。

 

建庫方法如何選擇？

 

1.什么是鏈特異性文庫

 

鏈特異性建庫可以保留測序時轉錄本的方向信息，即可以確定轉錄本是來源于基因組上面的正義鏈還是反義鏈，此外，還能確定基因結構，定量轉錄本，鑒定non-coding轉錄本等。

 

2.普通轉錄組與lncRNA建庫方法區別
 

普通轉錄組基于真核生物mRNA含有polyA尾的特性，先用oligodT磁珠富集純化，然后構建普通轉錄組文庫。

因只有部分lncRNA含有polyA尾，為獲得更多的lncRNA有效信息，選用去rRNA試劑盒進行富集，然后通過構建鏈特異性文庫以有效區分不同lncRNA類型及準確定位，保留RNA的方向性信息，以便更加準確的獲得基因的結構以及基因表達信息。
 

3.lncRNA測序前注意事項

 

1）必須有轉錄組，且參考基因組組裝水平及注釋信息完善，至少為scaffold水平。

2）需要有適用的去rRNA試劑盒。

 

目前主要應用的去rRNA試劑盒為Ribo-Zero以及KAPA試劑盒。對于非常規物種進行lncRNA測序時，需確定有無適用的去rRNA試劑盒，否則rRNA去除效果不佳會嚴重影響數據質量。

 

篇幅有限，今天就告一段落，本期總結了RNA-seq樣本準備和建庫問題，歡迎熱情點贊留言，小編會繼續整理分享，搓手抖腿期待中~~~我們下期不見不散~~~