本試劑盒適用于從各種原代或傳代細胞和各種動物實體組織，如腦、脊髓、神經結或纖維、脂肪、肝臟、消化道、腎臟、心臟、肌肉、血管、結締組織等動物組織中提取核蛋白和胞漿蛋白。提取過程簡單方便，可在1小時內完成。制備的核蛋白和胞漿蛋白不僅純度高，保持天然活性，且較少交叉污染。...

產品特點：

● 使用方便，從細胞組織中提取蛋白不需經過研磨、反復凍融、超聲破碎等前處理。

● 將蛋白提取的時間縮短至30分鐘-1小時。

● 含蛋白穩定劑，提取的蛋白穩定。

● 紫外檢測蛋白濃度時，背景干擾低。

● 蛋白提取液含多種有效成分，可以充分釋放胞漿蛋白、核蛋白，又可結合釋出的蛋白防止沉淀。

● 蛋白酶抑制劑抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制劑配方優化。蛋白酶抑制劑混合物包含6種獨立的蛋白酶抑制劑；每一種抑制劑可特異性抑制某一種或幾種蛋白酶活性。該混合物優化的組成使其可以抑制幾乎所有重要的蛋白酶活性，包括絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。

適用樣本：

● 組織 ● 細胞

試劑盒以外自備試劑和儀器：

● 移液器 ● 離心機 ● 振蕩器 ● 渦旋混勻器 ● PBS ● 蛋白定量試劑盒

注意事項：

● 旋帽離心管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內壁上的液體甩至管底，避免開蓋時液體灑落。

● 實驗過程中的所有試劑須預冷；所有器具須放-20℃冰箱預冷。整個過程須保持樣品處于低溫。

● 蛋白酶抑制劑儲存期間溶液如果出現沉淀，不影響使用，溶解后正常使用。

● 如試劑盒不能短時間內用完，蛋白酶抑制劑混合物不可以一次全部加入提取液。

● 可以根據自己實驗需要加入其它蛋白酶抑制劑單品。

● Western實驗內參可以選用Lamin A、Lamin B、TBP、Histon H3.

使用方法：

1、提取液制備：

每200μL冷蛋白提取液B中加2μL蛋白酶抑制劑混合物，充分混勻后置冰上備用。

【注】：

● 根據需要處理的樣品數量準備蛋白提取液，蛋白酶抑制劑混合物不可以一次全部加入提取液，磷酸酶抑制劑可以一次加入。

● 加過蛋白酶抑制劑的提取液一周內未用完，再次用前需再次加入蛋白酶抑制劑。

● 以下步驟中使用的蛋白提取液為此步配好的含蛋白酶抑制劑的提取液。

2、樣本解凍后，取適量組織樣本用手術剪刀盡可能剪碎，加冷PBS，用組織勻漿器勻漿至無明顯肉眼可見固體。

【注】：

● 細胞樣本直接按下面的第四步驟開始操作。

3、勻漿液在4℃，1000×g條件下離心3分鐘，棄上清，收集沉淀。

4、每20-40μL細胞沉淀體積中加入200μL冷的提取液A，告訴渦旋振蕩15秒或吹打混勻，置2-8℃條件振蕩20-30分鐘。

【注】：

● 提取液A處理后細胞體積應減少，否則延長提取液A振蕩處理時間。

● 使用振蕩器/搖床的較低轉速,提取液能輕微晃動即可。

● 沒有振蕩條件也可不振蕩,稍微延長提取液的的處理時間,中間每隔幾分鐘用移液器吹打混勻即可。

● 或者按每20-50mg組織重量加200μL試劑A。

5、在4℃，2000×g力條件下離心10分鐘，棄上清，收集沉淀。

6、在沉淀中加入80-200μL冷的蛋白提取液B，高速渦旋振蕩15秒。

【注】：

● 提取液B用量根據實驗細胞數量情況調整，細胞數量多則多加，也可根據預實驗時最終蛋白濃度試劑情況調整。

● 加提取液B前，必須盡可能吸干提取液A，否則會影響核蛋白純度。

● 對核蛋白純度要求較高時，也可以用PBS將沉淀洗滌一次。PBS重懸沉淀，2000×g離心5分鐘后收集沉淀再加提取液B。

7、置2-8℃條件振蕩30-40分鐘。

● 使用振蕩器/搖床的較低轉速,提取液能輕微晃動即可。

● 沒有振蕩條件也可不振蕩,稍微延長提取液的的處理時間,中間每隔幾分鐘用移液器吹打混勻即可。

● 此步驟蛋白提取液處理產物中有時會出現少量透明膠狀物，屬正?，F象。該透明膠狀物為含有基因組DNA等的蛋白復合物。不檢測和基因組DNA結合特別緊密的特定蛋白的情況下，可以直接離心取上清進行后續試驗即可；如果需要檢測和基因組結合特別緊密的蛋白，則可以通過超聲處理，300w/10秒間隔10秒，超聲3分鐘，隨后離心取上清用于后續實驗。檢測一些常見的轉錄因子，例如NF-kappaB、p53等時，不必進行超聲處理。如引入其他外源性蛋白質不影響下游實驗的話，也可以加入DNase處理。

8、在4℃，12000×g條件下離心10分鐘。棄沉淀，收集上清。

9、將上清吸入另一預冷的干凈離心管，即可得到核蛋白。

10、將上述蛋白提取物定量后分裝于-80℃冰箱保存備用或直接用于下游實驗。

【注】：

● 建議用BCA法進行蛋白定量。

● 蛋白樣品-80℃存放一年沒有問題。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被細菌污染。

常見問題分析：

● 核蛋白濃度低？

核蛋白豐度較低，需要足夠細胞數量提取，在條件允許情況下，盡可能加大細胞量。

注意用蛋白提取液B處理時沒有裂解完全，導致蛋白濃度低。只要適當延長試劑B的處理時間即可。最好在持續振蕩的條件下處理，沒有振蕩器也可間隔幾分鐘用吸頭吹打混勻，至無明顯沉淀。

● 用什么方法定量蛋白？

建議用BCA法。不適合用Bradford法，因為試劑A中含有干擾Bradford法的組份，導致定量不準。如果已經進行過透析處理或者用脫鹽柱改換過緩沖體系，則可以用Bradford法定量。

● 提取的蛋白具有活性嗎？

本試劑盒不含有離子型去垢劑組份，不破壞蛋白的結構，沒有對蛋白質之間原有的相互作用的破壞，蛋白均保持其天然構象和活性。

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