活性氧(Reactive oxygen species,ROS)包括超氧自由基、過氧化氫、及其下游產物過氧化物和羥化物等，參與細胞生長增殖、發育分化、衰老和凋亡以及許多生理和病理過程。本產品利用新型熒光探針O12進行血清中活性氧檢測的試劑盒。本試劑盒中的O12 ROS探針為綠色熒光的活性氧探針，具有488/520nm的最大激發/發射波長。...

樣本類型：

● 新鮮血清 ● 凍存血清

試劑盒以外自備儀器和試劑耗材：

● 熒光分光光度計或熒光酶標儀，激發波長488nm，發射波長520±10nm，或者按照FITC熒光檢測條件檢測。 ● 離心機 ● 移液器 ● PBS緩沖液

使用注意事項：

● 螺旋蓋微量管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內壁上的液體收集至管底，避免開蓋時液體灑落。

● O12染色液為DMSO溶液，冬季氣溫較低時在室溫時為凝固狀態，極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱溶解，吸頭也需要放在培養箱預熱，否則容易再次凝固在吸頭內壁產生損耗。

● 使用前先將本品取出回至室溫，并對其進行簡短離心使DMSO溶液集中于管底。

● 盡量縮短探針標記后到測定所用的時間，以減少各種可能的誤差。

使用方法：

試劑準備：

根據樣本數量，用純水將O12探針10倍稀釋。充分混勻，備用。

【注】：

● 不可以一次性將探針全部稀釋。

● 現配現用。

● 也可以不稀釋探針，直接在待檢測血清樣品中加入1μL探針，但是需要用好的移液器和吸頭，注意操作過程，保證探針有效的加入了樣品中，并充分混勻。

● O12探針為DMSO溶液，冬季氣溫較低時在室溫時為凝固狀態，極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱溶解，變成液體狀態后離心至管底再開蓋使用。

● 微量操作時，注意探針要有效加入血清，避免沒有加入。

● 以下步驟使用的O12探針為此步驟稀釋過的探針

樣本檢測：

1. 在96孔板中加入100μL新鮮血清樣本、10μL O12探針，用移液器吹打，使之充分混勻。

【注】：

● 注意選擇合適的96孔板，熒光檢測需要使用黑色板。

● 不同樣本的活性氧差異較大，需要根據預實驗結果調整探針用量。一般加入10μL探針，染色終濃度按試劑盒中探針母液的100-1000倍稀釋，100倍稀釋適合大多數樣本。

● 如果熒光強度太強，超過了檢測儀器的量程，可以稀釋后再檢測。

● 以酶標儀檢測為例，也可以用熒光分光光度計檢測，根據所使用儀器決定勻漿液體積和染色容器。

2. 在37℃避光孵育15-30分鐘。

3. 置于熒光光度計或酶標儀中，后于激發波長為488nm、發射波長520nm檢測熒光強度。

【注】：

● 熒光強度強則活性氧含量高。

● 可以用實驗中對照血清樣本的熒光強度值為基準，待測模型組血清的熒光強度值占對照血清的百分比來比較活性氧程度差異。

● 或使用熒光光度計等其他熒光設備。

● 如果熒光強度太強，超過了儀器的檢測范圍，可以將孵育后的血清稀釋后再檢測。

常見問題分析：

● 活性氧結果如何分析？

ROS是多種物質的統稱，不像某一單一活性氧指標，無法檢測其絕對的含量，只能通過設置參照樣本，以參照樣本的倍數來反映目標樣本相對含量變化，這個“相對”是針對參照的。分析結果是定性的，也是沒有單位的，因為它本質上是一個比值（目標/參照）。反映的是模型樣本通過具體的干預措施（如養分缺失、缺氧、藥物治療或遺傳基因操控等）如何影響其ROS的變化，測定其ROS是增加或者降低了。

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