微量樣本總RNA提取試劑盒的品牌是百奧萊博，是優質的RNA提取純化產品，本制品僅用于生物化學研究方面，本品質量穩定，價位合理，需要微量樣本總RNA提取試劑盒等RNA提取純化產品的客戶，歡迎您的隨時垂詢。...

特別提示：包括微量樣本總RNA提取試劑盒在內，本公司的所有產品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫療及其他非科研用途！

產品名稱：微量樣本總RNA提取試劑盒
英文名稱：Total RNA Extraction Kit from trace sample
產品貨號：WH0059
產品規格：50次

本試劑盒采用、專一結合核酸的離心吸附柱和獨特的緩沖系統，可從多種不同類型的微量樣品中快速提取總RNA。本試劑盒特別加入了Carrier RNA，可以從體系中輕松捕獲微量核酸,具有方便快捷、產量高、重復性好的特點，30-40分鐘內即可完成反應。與其它提取RNA的普通方法相比，微量樣品RNA提取試劑盒將所有<200bp的RNA（5.8S rRNA,5S rRNA和tRNAs等）選擇性的篩除，而所有>200bp的RNA則被富集、分離和純化。提取的總RNA純度高，沒有DNA和蛋白質污染。

產品特點：
·從微量的樣本中純化得到的高質量的RNA，如顯微切割得到的組織，纖維組織和細胞。
·配有的DNase Ⅰ，可有效去除DNA污染。
· RNA純度更高，無雜質殘留，特別適合于對純度要求很高的下游實驗。
·操作安全可靠，無需酚/氯fǎng抽提，無需氯化銫梯度離心，無需氯化鋰或乙醇沉淀。

下游應用：
· RT-PCR。
· Northern Blot、Dot Blot。
· Real-Time PCR。
·芯片分析。
· polyA篩選、體外翻譯、RNase保護分析和分子克隆。

Carrier RNA的作用：
試劑盒中提供了一種特殊Carrier RNA，當需要從非常少量的樣品中提取RNA時，推薦在操作步驟中加入Carrier RNA，這樣有助于提高RNA與吸附柱的結合。

試劑盒組成：

組分	50T
裂解液RL	30ml
去蛋白液RW1	40ml
漂洗液RW	12ml
Carrier RNA	310μg
DNase I	1500U
緩沖液RDD	4ml
RNase-Free ddH2O（管裝)	1ml
RNase-Free ddH2O（瓶裝)	2×15ml
RNase-Free吸附柱CR1（含2ml收集管)	50套
RNase-Free離心管（1.5ml)	50個

儲存條件：在室溫（15-25℃)條件下運輸，收到試劑盒后，請立即將RNase-free DNase I,緩沖液RDD和RNase-free ddH2O置于2-8℃保存，其他試劑可置于室溫（15-25℃)保存。

選配試劑：蛋白酶K（目錄號：WH0215）；研磨杵（目錄號：WH9004）；過濾柱CS：（目錄號：RK124）

自備試劑：β-巰基乙醇、無水乙醇

使用前注意事項：
1．為了防止RNA的降解，請避免未處理的樣品在室溫長時間放置，在組織固定前，RNA處于無保護狀態，所以請將組織在液氮中速凍。
2．組織裂解液（在裂解液RL中）可在-70℃儲存數月。處理凍存的裂解液時，可在室溫或37℃水浴中將樣品完全解凍，而且請注意裂解液中的鹽需要完全溶解，之后立即進行后續操作。（長時間37℃處理將會導致RNA的化學降解）。
3．所有步驟在室溫進行，為了盡量避免RNA的降解，操作越快越好。
4．在使用前，請用RNase-Free ddH2O配制乙醇溶液。
5．操作前在RL中加入β-巰基乙醇至終濃度1%，如1ml RL中加入10μl β-巰基乙醇。此裂解液zuì好現用現配。配好的RL可在4℃放置一個月，裂解液RL在儲存時可能會形成沉淀，如果有沉淀出現，請加熱溶解后使用。
6．次使用前應在漂洗液RW中加入無水乙醇，加入量請參見瓶上標簽。

表1：微量樣品RNA提取試劑盒技術指標

zuì大吸附能力	45μg RNA
吸附柱zuì大容量	700 μl
提取RNA的長度	>200 bp
zuì小洗脫體積	10μl
樣品使用zuì大量（動物細胞）	5×105
樣品使用zuì大量（動物組織）	5mg

  注意：如果超出該試劑盒的zuì大吸附能力，RNA的產量可能會降低，而如果樣品未能裂解完全，RNA的產量也會降低。

表2：不同培養條件下HeLa細胞的數量

細胞培養器皿	生長面積（cm2）	細胞數量
96孔細胞培養板	0.32-0.6	4-5×104
48孔細胞培養板	1	1×105
24孔細胞培養板	2	2.5×105
12孔細胞培養板	4	5×105
6孔細胞培養板	9.5	1×106
平皿（35mm）	8	1×106
搖瓶（40-50ml）	25	3×106

3．樣品的儲存和處理
組織若不經過處理，其中的RNA處于無保護狀態，容易被降解，所以新鮮組織應及時放入液氮中速凍并立即儲存于-70℃，凍存的組織不能反復凍融以避免RNA的降解，樣品也可以在勻漿后加入裂解液RL，儲存于-70℃，凍存的樣品可穩定儲存數月。
4．樣品的裂解和勻質
有效的裂解和勻質是提取RNA的重要步驟，裂解和勻質是兩個不同的步驟。
裂解：將組織和細胞完全裂解，以徹底釋放出樣品中所有的RNA，不同的樣品裂解的方法不同，如果樣品裂解不徹底，將導致RNA得率低。
勻質：勻質的過程是為了降低細胞裂解后的溶液粘度，將高分子量的基因組DNA和其他物質切斷，形成均一的溶液，利于RNA與硅基質膜的結合。如果勻質過程未處理好，將影響RNA與硅基質膜的結合，從而導致RNA提取量低。勻質的方法包括勻漿、渦旋振蕩、過濾柱、注射器或槍頭吸取等。
5．Carrier RNA：
當處理<10 μg組織或<5000個細胞時，可將試劑盒中提供的Carrier RNA加入裂解液中，實驗證明，Carrier RNA的加入將提高RNA的得率，且不會影響后續實驗。

相關溶液的配制：

DNase I儲存液的配制：請小心打開裝有DNase I的玻璃管蓋子，以避免造成DNase I的損失，將DNase I干粉（1500U）溶解在550μl RNase-Free水中，輕柔地上下顛倒混勻DNase I溶液，不要渦旋振蕩。
如需長時間保存DNase I溶液，請將玻璃瓶中的DNase I溶液進行分裝，在-20℃可保存9個月，DNase I溶液融化后可在2-8℃保存6周，溶解后的DNase I溶液不能再次冷凍。

Carrier RNA儲存液的配制：在次使用Carrier RNA時，將Carrier RNA（310 μg）溶解在1ml RNase-Free ddH2O中，將溶液分裝后儲存于-20℃，此時該溶液的濃度為310 μg/ml（310ng/μl）；該儲存液應避免反復凍融，凍融次數不能超過3次。（當處理的細胞量小于5000個時，請在裂解液中加入Carrier RNA。）

Carrier RNA工作溶液的配制（以配制10次用量為例）：將5 μl Carrier RNA儲存溶液加入34 μl裂解液RL中，用移液器混勻，將混勻后的溶液6 μl加入54 μl裂解液RL中，此時Carrier RNA終濃度為4 ng/μl，取5 μl終濃度為4 ng/μl的Carrier RNA加入裂解液中。

操作步驟：

一、從微切割的冷凍樣品中提取總RNA
以下的操作步驟適用于從冷凍的微切割動物組織中分離RNA。要從非常微量的樣品中提取RNA是一項很有挑戰性的工作，同時要注意，固定和處理樣品的過程可能會對RNA完整性造成影響。

1．向樣品中加入適量的裂解液RL（使用前請加入β-巰基乙醇，終濃度為1%) （加入裂解液RL的體積與微切割儀器容積有關，但不能超過zuì大體積為（A) 65 μl （B) 300 μl。)
  注意：（A)指的是微切割儀器Leica AS LMD系統可采用的體積，（B)指的是其他微切割系統可使用的裂解液體積，以下出現的（A) （B)與此一致。
2．如果需要，可將樣品和裂解液RL轉移至一個較大的1.5 ml或2 ml RNase-Free的離心管中（客戶自備）。補充裂解液RL至體積為（A)75 μl （B)350 μl。
  注意：（A) （B)所指的意義同步驟1，當處理的細胞量小于5000個時，向溶液中加入20 ngCarrier RNA（5 μl 4 ng/μl Carrier RNA），Carrier RNA溶液的配制請見第4頁溶液配制說明。
3．渦旋振蕩30 sec，使樣品勻質化。
4．向樣品中加入1倍體積（（A)75 μl （B)350 μl）70%乙醇，用移液器混勻，立即進行第5步。
  注意：如果在勻質的過程中損失了一些裂解液，70%乙醇的加量也要相應減小。在加入乙醇后，溶液中可能會出現沉淀，但不會影響RNA的提取。
5．將所有溶液及沉淀全部轉移至吸附柱CR1上（吸附柱CR1放在RNase-Free的2 ml收集管中，該收集管試劑盒中已經備有)，輕柔地蓋上管蓋，12000rpm （~13400×g )離心30sec，倒掉廢液，將吸附柱CR1放回收集管中。
6．向吸附柱CR1中加入350 μl去蛋白液RW1，12000rpm（~13400×g)離心30-60 sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR1放回收集管中。
7．DNase I工作液的配制：取10μl DNase I儲存液放入新的RNase-Free離心管中，加入70 μl RDD溶液，輕柔混勻。
8．向吸附柱CR1中央加入80 μl的DNase I工作液，室溫放置15min。
9．向吸附柱CR1中加入350 μl去蛋白液RW1，12000rpm（~13400×g)離心30-60 sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR1放回收集管中。
10．向吸附柱CR1中加入500 μl漂洗液RW （使用前請先檢查是否已加入乙醇），室溫靜置2 min，12000rpm（~13400×g)離心30-60 sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR1放回收集管中。
11．重復步驟10。
12．12000rpm（~13400×g)離心2 min，倒掉廢液。將吸附柱CR1置于室溫放置數分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。
  注意：此步驟目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，離心后將吸附柱CR1在室溫放置片刻，以充分晾干。如果有漂洗液殘留，可能會影響后續的RT等實驗。
13．將吸附柱CR1放入一個新的RNase-Free離心管（試劑盒中已備用）中，向膜中央加入14 μl RNase-Free ddH2O，輕柔地蓋上管蓋，室溫放置2 min。12000rpm （~13400×g)離心1min，所得溶液即為RNA溶液。
  注意：洗脫體積不得少于10μl，可用減小洗脫體積的方法得到較高濃度的RNA，但是這將影響總的RNA得率。


二、從福爾馬林固定的微切割樣品中提取總RNA
以下操作步驟適用于從福爾馬林固定的微切割樣品中提取總RNA。在從福爾馬林固定的微切割樣品中提取RNA時，主要的影響因素有：樣品的新舊程度、固定的過程和樣品的儲存條件。RNA可能會降解成<300bp的片段，而本試劑盒能有效吸附>200bp的片段，所以如果樣品中的RNA高度降解，可能會出現提不出RNA的情況。

1．預先加熱水浴至55℃，為第5步中的蛋白酶K（客戶自備，目錄號：WH0215）消化做準備。
2．向樣品中加入適當體積的裂解液RL（使用前請向RL中加入β-巰基乙醇，終濃度1％），加入裂解液RL體積與微切割儀器的容積有關，但不能超過140 μl。
3．如果需要，可以將樣品和裂解液RL轉移至1.5 ml或2 ml的RNase-Free的離心管中（客戶自備）。補充裂解液RL至體積為150 μl。
  注意：當處理的細胞量小于5000時，向溶液中加入20 ng Carrier RNA （5 μl 4 ng/μl Carrier RNA工作液），Carrier RNA工作溶液的配制請見第4頁溶液配制說明。
4．向溶液中加入295 μl RNase-Free ddH2O，然后加入5 μl蛋白酶K溶液（濃度20 mg/ml，客戶自備)，用移液器混勻，55℃孵育10 min。室溫12000rpm （~13400×g)離心3min。
  注意：此時的組織碎片可能會形成小球，有時在溶液上面會浮有一層薄膜。
5．用移液器將上層溶液（450 μl左右）轉移至一個新的RNase-Free離心管中（客戶自備）。
  注意：使用移液器吸取上層溶液時，一定要避免接觸到組織碎片小球，而且槍頭要伸到薄膜以下進行吸取，避免將薄膜轉移至離心管中。
6．向吸出的上層溶液中加入0.5倍體積的無水乙醇（通常為225 μl），用移液器混勻。
  注意：在加入乙醇后，溶液中可能會出現沉淀，但是不會影響RNA的提取。
7．將所有溶液及沉淀全部轉移至吸附柱CR1上（吸附柱CR1放在2 ml收集管中，此收集管試劑盒已經備有），輕柔地蓋上管蓋，12000rpm （~13400×g )離心30-60 sec，倒掉廢液，將吸附柱CR1放回收集管中。
8．向吸附柱CR1中加入350 μl去蛋白液RW1，12000rpm（~13400×g)離心30-60 sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR1放回收集管中。
9．DNase I工作液的配制：取10μl DNase I儲存液放入新的RNase-Free離心管中，加入70μl RDD溶液，輕柔混勻。
10．向吸附柱CR1中央加入80 μl的DNase I工作液，室溫放置15min。
11．向吸附柱CR1中加入350 μl去蛋白液RW1，12000rpm（~13400×g)離心30-60 sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR1放回收集管中。
12．向吸附柱CR1中加入500 μl漂洗液RW （使用前請先檢查是否已加入乙醇），室溫靜置2 min，12000rpm（~13400×g)離心30-60 sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR1放回收集管中。
13．重復步驟12。
14．12000rpm（~13400×g)離心2 min，倒掉廢液。將吸附柱CR1置于室溫放置數分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。
  注意：此步驟目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，離心后將吸附柱CR1在室溫放置片刻，以充分晾干。如果有漂洗液殘留，可能會影響后續的RT等實驗。
15．將吸附柱CR1放入一個新的1.5 ml RNase-Free離心管中（試劑盒中已備有），向膜中央加入14 μl RNase-Free ddH2O，輕柔地蓋上管蓋，室溫放置2 min。12000rpm（~13400×g )離心1 min，所得溶液即為RNA溶液。
  注意：洗脫體積不得少于10μl，可用減小洗脫體積的方法得到較高濃度的RNA，但是這將影響總的RNA得率。

三、從動物組織中提取總RNA
以下操作適用于從大多數動物組織中提取RNA，如果要從纖維組織中提取RNA，請參考后面的相關方法。從動物組織中提取RNA，若要得到高純度和高產量的RNA，組織的起始量非常重要，本試劑盒提供的吸附柱CR1zuì大結合能力為45μg，裂解液zuì多能裂解5mg的組織。有些組織像脾臟、部分腦組織、肺組織和胸腺組織在提取的過程中有可能會形成一些沉淀，但不會影響RNA的提取。推薦使用的組織量不超過5mg，請不要超過吸附柱CR1的載量，否則將會降低RNA的產量和純度。

1．確定組織的總量，不要超過5mg，立即進行第2步。
2．在裂解液RL（使用前請加入β-巰基乙醇，終濃度為1％)中將組織塊切碎和勻漿（請見步驟2a，2b）
  注意：組織塊的切碎和勻漿過程可采用下列2a和2b兩種方法之一，當處理小于10 μg的組織時，需要向裂解液中加入20 ng Carrier RNA工作溶液（5 μl 4 ng/μl)，Carrier RNA工作溶液的配制請見第4頁溶液的配制說明。勻漿不徹底將導致RNA提取量低，還可能導致堵塞吸附柱CR11的現象發生。
2a 使用勻漿器進行勻漿：將稱重過的組織塊放在一個大小合適的容器中，加入350 μl裂解液RL，立即進行勻漿至均一溶液（通常時間為20-40 sec），繼續步驟3。
2b 使用研磨杵（客戶自備，目錄號：WH9004）進行研磨：在1.5 ml RNase-Free的離心管中（客戶自備）加入350 μl裂解液RL，將組織塊迅速從-80℃轉入這個離心管中，用研磨杵充分研磨，徹底將組織破碎，注意避免組織凍融。將此溶液移至過濾柱CS（客戶自備，定購信息見第1頁）上（過濾柱CS放在收集管中)，12000rpm （~13400×g )離心2 min，收集濾液，繼續步驟3。
3．將勻漿好的樣品（2a）或者過濾液（2b）以12000rpm （~13400×g )離心3 min，用移液器仔細將上清液轉移到新的1.5 ml RNase-Free離心管中（客戶自備）。
4．向上清中加入1倍體積（350 μl)70%乙醇，用移液器混勻，立即進行第5步。
  注意：如果在以上過程中損失了一些裂解液，70%乙醇的加量也要相應減小。在乙醇加入后，溶液中可能會出現沉淀，但不會影響RNA的提取。
5．將所有溶液及沉淀全部轉移至吸附柱CR1上（吸附柱CR1放在2 ml收集管中，試劑盒中已備有），輕柔地蓋上管蓋，12000rpm （~13400×g )離心30-60 sec，倒掉廢液，將吸附柱CR1放回收集管中。
6．向吸附柱CR1中加入350 μl去蛋白液RW1，12000rpm（~13400×g)離心30-60 sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR1放回收集管中。
7．DNase I工作液的配制：取10μl DNase I儲存液放入新的RNase-Free離心管中，加入70 μl RDD溶液，輕柔混勻。
8．向吸附柱CR1中央加入80 μl的DNase I工作液，室溫放置15min。
9．向吸附柱CR1中加入350 μl去蛋白液RW1，12000rpm（~13400×g)離心30-60 sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR1放回收集管中。
10．向吸附柱CR1中加入500 μl漂洗液RW （使用前請先檢查是否已加入乙醇），室溫靜置2 min，12000rpm（~13400×g)離心30-60 sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR1放回收集管中。
11．重復步驟10。
12．12000rpm（~13400×g)離心2 min，倒掉廢液。將吸附柱CR1置于室溫放置數min，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。
  注意：此步驟目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，離心后將吸附柱CR1在室溫放置片刻，以充分晾干。如果有漂洗液殘留，可能會影響后續的RT等實驗。
13．將吸附柱CR1放入一個新的RNase-Free離心管中（試劑盒中已備有），向膜中央加入14 μl RNase-Free ddH2O，輕柔地蓋上管蓋，室溫放置2 min。12000rpm （~13400×g)離心1 min，所得溶液即為RNA溶液。
  注意：洗脫體積不得少于10μl，可用減小洗脫體積的方法得到較高濃度的RNA，但是這將影響總的RNA得率。

四、從纖維組織中提取總RNA
纖維組織，例如骨骼肌、心臟、皮膚中含有大量的收縮蛋白、連接組織和膠原質，只有去除這些蛋白質，才能使RNA的提取順利進行。所以在從纖維組織中提取總RNA時，引入了蛋白酶K消化這一過程。
采用以下操作，可成功地從心臟、肌肉和皮膚組織中提取RNA，其他富含蛋白質的組織也可采用此方法進行RNA的提取，值得注意的是，在進行蛋白酶K消化過程中的緩沖液不能對RNase進行長期有效的抑制，因而此方法不適用于含有豐富RNase的脾臟和腸組織等RNA的提取。
推薦使用的組織量不超過5mg，請不要超過吸附柱CR1的載量，否則將會降低RNA的產量和純度。

1．預先加熱水浴至55℃，為第5步中的蛋白酶K（客戶自備，目錄號：WH0215）消化做準備。
2．確定組織的總量，不要超過5mg，立即進行第3步。
3．在裂解液RL（使用前請加入β-巰基乙醇，終濃度為1％）中將組織塊勻漿（3a）或者研碎（3b）。
  注意：當處理小于10 μg的組織時，需要向裂解液中加入20 ng Carrier RNA工作液（5 μl 4 ng/μl溶液)，Carrier RNA溶液的配制請見第4頁溶液的配制說明。勻漿不徹底會導致RNA提取量低，還可能導致吸附柱CR1堵塞。采用勻漿器或過濾柱進行勻漿，會比采用其他方式勻漿獲得更高的RNA得率。
3a 使用勻漿器進行勻漿：將稱重過的組織塊放在一個大小合適的容器中，加入150 μl裂解液RL，立即進行勻漿至均一溶液（通常時間為20-40 sec），繼續步驟4。
3b 使用用研磨杵（客戶自備，目錄號：WH9004）進行研磨：在1.5 ml RNase-Free的離心管中（客戶自備）加入150 μl裂解液RL，將組織塊迅速從-80℃轉入這個離心管中，用研磨杵充分研磨，徹底將組織研碎，注意避免組織凍融，繼續步驟4。
  注意：當使用研磨杵研磨時，請務必將組織徹底研碎，以保證裂解充分
4．向溶液中加入295 μl RNase-Free ddH2O，然后加入5 μl蛋白酶K溶液（濃度為20 mg/ml，客戶自備，目錄號：WH0215），用移液器混勻。55℃孵育10 min。室溫12000rpm（~13400×g )離心3 min。
  注意：此時的組織碎片可能會形成小球，有時在溶液上面會浮有一層薄膜。
5．用移液器將上層溶液（通常450 μl左右）轉移至一個新的1.5 ml RNase-Free的離心管中（客戶自備）。
  注意：使用移液器吸取上層溶液時，一定要避免接觸到組織碎片小球，而且槍頭要伸到薄膜以下進行吸取，避免將薄膜轉移至離心管中。
6．向吸出的上層溶液加入0.5倍體積的無水乙醇（通常為225 μl），用移液器混勻。
  注意：在乙醇加入后，溶液中可能會出現沉淀，但是不會影響RNA的提取。
7．將所有溶液及沉淀物質全部轉移至吸附柱CR1上（吸附柱CR1放在2 ml收集管中，試劑盒已經備有），輕柔地蓋上管子，12000rpm （~13400×g )離心30-60 sec，倒掉廢液，將吸附柱CR1放回收集管中。
8．向吸附柱CR1中加入350 μl去蛋白液RW1，12000rpm（~13400×g)離心30-60 sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR1放回收集管中。
9．DNase I工作液的配制：取10μl DNase I儲存液放入新的RNase-Free離心管中，加入70 μl RDD溶液，輕柔混勻。
10．向吸附柱CR1中央加入80 μl的DNase I工作液，室溫放置15min。
11．向吸附柱CR1中加入350 μl去蛋白液RW1，12000rpm（~13400×g)離心30-60 sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR1放回收集管中。
12．向吸附柱CR1中加入500 μl漂洗液RW （使用前請先檢查是否已加入乙醇），室溫靜置2 min，12000rpm（~13400×g)離心30-60 sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR1放回收集管中。
13．重復步驟12。
14．12000rpm（~13400×g)離心2 min，倒掉廢液。將吸附柱CR1置于室溫放置數分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。
  注意：此步驟目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，離心后將吸附柱CR1在室溫放置片刻，以充分晾干。如果有漂洗液殘留，可能會影響后續的RT等實驗。
15．附柱CR1放入一個新的RNase-Free離心管（試劑盒中已備用）中，向膜中央加入14 μl RNase-Free ddH2O，輕柔地蓋上管蓋，室溫放置2 min。12000rpm （~13400×g )離心1 min，所得溶液即為RNA溶液。
  注意：洗脫體積不得少于10μl，可用減小洗脫體積的方法得到較高濃度的RNA，但是這將影響總的RNA得率。


五、從動物細胞中提取總RNA
從動物細胞中提取RNA，若要得到高純度和zuì佳產量的RNA，細胞的起始量非常重要，本試劑盒提供的吸附柱CR1zuì大結合能力為45μg，而裂解液zuì多能裂解5×10⁵的細胞。推薦使用的細胞量不超過5×10⁵，請不要超過吸附柱CR1的載量，否則將會降低RNA的產量和純度。

1．細胞的處理和裂解
1a 細胞沉淀：輕彈管底使細胞分開，加入350 μl裂解液RL（使用前請加入β-巰基乙醇，終濃度為1%），渦旋振蕩或用移液器混勻，繼續步驟2。
1b 懸浮培養細胞：確定細胞的數量（見表2），在RNase-Free的離心管（客戶自備）中300×g離心5 min沉淀細胞，去除所有上清，加入350 μl裂解液RL（使用前請加入β-巰基乙醇，終濃度為1%），繼續步驟2。
1c 單層貼壁細胞：對于該種細胞的收集可直接在細胞培養器皿中進行（直徑zuì大為10cm），或者可以先用胰蛋白酶消化，再收集細胞沉淀，進行裂解。
  直接在細胞培養器皿中進行裂解：確定細胞數量，將細胞培養基完全吸出，加入350 μl裂解液RL（使用前請加入β-巰基乙醇，終濃度為1%）裂解細胞，收集細胞裂解液并將其轉移至1.5 ml RNase-Free離心管（客戶自備）中，渦旋振蕩或用移液器混勻，確保看不見任何成團的細胞之后，繼續步驟2。
  胰蛋白酶消化（搖瓶中培養的單層貼壁細胞，通常采用胰蛋白酶消化的方法)：確定細胞數量，吸出培養基，用PBS緩沖液洗細胞，吸除PBS緩沖液，加入含有0.10-0.25%胰蛋白酶的PBS緩沖液處理細胞，在細胞脫離容器壁后，加入含有血清的溶液使胰蛋白酶失活，將細胞轉移到RNase-Free的離心管中，300×g離心5 min沉淀細胞，仔細去除所有上清。加入350 μl裂解液RL（使用前請加入β-巰基乙醇，終濃度1%）裂解細胞。繼續步驟2
  注意1：如果細胞培養基沒有去除干凈，將會稀釋裂解液，影響裂解效果及RNA與硅膠樹脂膜的結合，這將導致RNA的提取量降低。
  注意2：當處理的細胞量≤1×10⁵時，裂解液RL的加量可以減少至75 μl，這時可采用小一些的離心管，渦旋振蕩1 min使裂解液勻質化，進行步驟3。
  注意3：如果處理細胞量<5000時，需要向裂解液中加入20 ng Carrier RNA （5 μl 4 ng/μl溶液)，Carrier RNA溶液的配制請見第四頁溶液配制說明。
  注意4：如果細胞重懸不完全，將會導致裂解不充分，降低RNA的產率。
2．樣品的勻質化（請見步驟2a，2b）
  注意：勻質不徹底將導致RNA提取量低，還可能導致吸附柱CR1堵塞，采用勻漿器或過濾柱進行勻質，會比采用其他方式勻漿獲得更高的RNA得率。
2a 將加入裂解液的細胞轉移至過濾柱CS（客戶自備，訂購信息見第1頁）上（過濾柱CS放在收集管中)，12000rpm （~13400×g )離心2 min，收集濾液，繼續步驟3。
2b 使用勻漿器勻漿30 sec。
3．加入1倍體積（通常為350 μl）70%乙醇，用移液器混勻，立即進行第4步。
  注意：如果在勻質的過程中損失了一些裂解液，70%乙醇的加量也要相應減小。如果在第2步中只加入了75 μl的裂解液RL，則在本步驟中也只需加入75 μl的70%乙醇，加入乙醇后，溶液中可能會出現沉淀，但是不會影響RNA的提取。
4．將所有溶液及沉淀全部轉移至吸附柱CR1上（吸附柱CR1放在2 ml RNase-Free的收集管中，此收集管試劑盒中已經備有），輕柔地蓋上管蓋，12000rpm （~13400×g )離心30-60 sec，棄廢液，將吸附柱CR1放回收集管中。
5．向吸附柱CR1中加入350 μl去蛋白液RW1，12000rpm（~13400×g)離心30-60 sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR1放回收集管中。
6．DNase I工作液的配制：取10μl DNase I儲存液放入新的RNase-Free離心管中，加入70 μl RDD溶液，輕柔混勻。
7．向吸附柱CR1中央加入80 μl的DNase I工作液，室溫放置15min。
8．向吸附柱CR1中加入350 μl去蛋白液RW1，12000rpm（~13400×g)離心30-60 sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR1放回收集管中。
9．向吸附柱CR1中加入500 μl漂洗液RW （使用前請先檢查是否已加入乙醇），室溫靜置2 min，12000rpm（~13400×g)離心30-60 sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR1放回收集管中。
10．重復步驟9。
11．12000rpm（~13400×g)離心2 min，倒掉廢液。將吸附柱CR1置于室溫放置數分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。
  注意：此步驟目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，離心后將吸附柱CR1在室溫放置片刻，以充分晾干。如果有漂洗液殘留，可能會影響后續的RT等實驗。
12．將吸附柱CR1放入一個新的RNase-Free離心管（本試劑盒中已經備有）中，向膜中央加入14 μl RNase-Free ddH2O，輕柔地蓋上管蓋，室溫放置2 min。12000rpm（~13400×g )離心1 min，所得溶液即為RNA溶液。
  注意：洗脫體積不得少于10μl，可用減小洗脫體積的方法得到較高濃度的RNA，但是這將影響總的RNA得率。

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  本試劑盒用于從各種植物中提取純化高品質總RNA，也適用于真菌菌絲RNA的提取。獨特的Shredder分離柱，用于勻質化和過濾高粘度的植物或真菌裂解物，同時采用硅基質膜吸附RNA進行純化，使多聚糖等各種污染物通過洗滌被有效去除，經洗脫的RNA可直接用于各種下游實驗。由本試劑盒提取RNA分子量大于200堿基，純度高，幾乎無DNA殘留。如果是對微量DNA非常敏感的RNA實驗，殘留的DNA可利用無RNase的DNase在柱上進行消化去除。提取的RNA可用于Northern Blot、Dot Blot 、RT-PCR和體外翻譯等實驗。

試劑盒組成：

組份	50次
DNase I	1000 U
10×Reaction Buffer	1000μl
Buffer RL	35ml
Buffer RLC	35ml
Buffer RW1	40ml
Buffer RW2(濃縮液)	11ml
RNase-Free Water	10ml
過濾柱FL及收集管	50套
吸附柱RM及收集管	50套
RNase-Free離心管(1.5ml)	50個

保存條件：DNase I及10×Reaction Buffer -20℃保存，其它組分室溫(15～30℃)。

自備試劑：β-巰基乙醇、無水乙醇(新開封或提取RNA專用)。

實驗前準備及重要注意事項：
1、預防RNase污染，應注意以下幾方面：
① 使用無RNase的塑料制品和槍頭，避免交叉污染。
② 配制溶液應使用無RNase的水。
③ 操作人員戴一次性口罩和手套，實驗過程中要勤換手套。
2、預防RNase污染，應注意以下幾方面：
① 使用無RNase的塑料制品和槍頭，避免交叉污染。
② 玻璃器皿應在使用前于180℃高溫下干烤4小時，塑料器皿可在0.5 M NaOH中浸泡10分鐘，用水徹底沖洗后高壓滅菌。
③ 配制溶液應使用無RNase的水。
④ 操作人員戴一次性口罩和手套，實驗過程中要勤換手套。
3、提取的樣品避免反復凍融，否則影響RNA提取的量和質量。
4、Buffer RL在使用前請加入β-巰基乙醇，1ml Buffer RL加10μl β-巰基乙醇。加入β-巰基乙醇的Buffer RL室溫可保存1個月。Buffer RLC使用時不需加β-巰基乙醇。
5、次使用前應按照試劑瓶標簽的說明先在Buffer RW2中加入無水乙醇。
6、Buffer RL和Buffer RLC如果產生沉淀，請加熱使其溶解后室溫放置。
7、所有離心步驟均在室溫下進行，且所有操作步驟動作要迅速。

操作步驟：
1、50-100 mg植物組織在液氮中迅速研磨成粉末，加入600μl Buffer RL(使用前檢查是否加入β-巰基乙醇)或Buffer RLC。渦旋振蕩使其充分裂解。
注意：
① Buffer RL主要成分為異硫氰酸胍，適用于大多數植物組織的裂解。但有些植物組織(如玉米的胚乳)，由于次級代謝產物較特殊，異硫氰酸胍使樣品產生沉淀，導致RNA提取效果不佳，此時可加入Buffer RLC替代Buffer RL。
② 56℃孵育1-3分鐘有助于組織的裂解，但是淀粉含量高的植物不要進行高溫孵育。
2、將步驟1所得全部液體轉移至已裝入收集管的過濾柱中，12000rpm(~～13400×g)離心2分鐘，將收集管中的上清液轉移到一個新的離心管(自備)中。
注意：
① 在吸取液體時可以將槍頭剪掉，便于取樣。
② 過濾柱FL可以除去大部分的碎片，但仍會有小部分流出，離心后會在收集管內形成沉淀，在進行下一步時注意避免吸到沉淀。
3、在步驟2所得干凈的裂解液中加入0.5倍體積的無水乙醇，迅速混勻。
注意：加入乙醇后可能會產生沉淀，但不影響后續試驗。
4、將上步得到的溶液轉移到已裝入收集管的吸附柱中,若一次不能將全部溶液加入吸附柱中，請分兩次轉入; 12000rpm離心15秒，棄掉廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
5、向吸附柱中加入350μl Buffer RW1，12000rpm離心1分鐘，棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
6、配制DNase I 混合液：取52μl RNase-Free Water，向其中加入8μl 10×Reaction Buffer和20μl DNase I(1 U/μl)，混勻， 配制成終體積為80μl的反應液。
7、向吸附柱中直接加入80μl DNase I 混合液，20-30℃孵育15分鐘。
8、向吸附柱中加入350μl Buffer RW1, 12000rpm離心1分鐘，棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
9、向吸附柱中加入500μl Buffer RW2(使用前檢查是否加入無水乙醇), 12000rpm離心15秒,棄廢液。
10、重復步驟9。
11、將吸附柱放回收集管中，12000rpm離心1分鐘，將吸附柱置于室溫數分鐘，以徹底晾干吸附柱中的無水乙醇。
注意：這一步的目的是將吸附柱中殘余乙醇去除，乙醇殘留會影響后續的酶促反應(酶切、PCR等)。
12、將吸附柱裝入新的離心管中，向吸附膜的中間加入30-50μl RNase-Free Water，室溫放置1分鐘，12000rpm離心1分鐘，得到的RNA溶液保存在-70℃，防止降解。
注意：
① RNase-Free Water體積不應小于30μl，體積過小影響回收率。
② 如果要提高RNA的產量，可用30-50μl新的RNase-Free Water重復步驟12。
③ 如果要提高RNA濃度，可將得到的溶液重新加入到吸附柱中，重復步驟12。

儲存條件：室溫(15～30℃)。

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