DNA甲基化修飾試劑盒由北京百奧萊博供貨并提供相關技術服務支持，本品用于科研試驗，DNA甲基化修飾試劑盒是我司眾多優質基因結構和功能之一，質量堪比同類進口產品，價格非常優惠，目前正熱烈促銷中，恭候您的咨詢訂購。...

特別提示：包括DNA甲基化修飾試劑盒在內，本公司的所有產品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫療及其他非科研用途！

產品名稱：DNA甲基化修飾試劑盒
英文名稱：Embedded Bisulfite Modification Kit
產品貨號：BTN130301
產品規格：150次

亞硫酸氫鹽修飾DNA時要求DNA必須在單鏈狀態，反應還必須在低溫進行，常規的修飾試劑盒由于是在液相進行，要在低溫下讓DNA不相互復性而保持單鏈狀態非常棘手，所以常規修飾試劑盒的修飾效率一般都不高。此外，常規方法要切換反應液，有多次沉淀步驟，使得DNA的回收率一般都不超過50%。為克服這些缺點，本公司開發出了此升級產品。

產品特點：
1．用包埋的樣品進行所有操作，免去所有沉淀和純化步驟，大簡化了操作。
2．免去了DNA提取過程，所需實驗材料比常規方法更少，zuì少幾個細胞都可以，大地節約了寶貴材料，尤其適用于珍稀材料。
3．包埋處理后，DNA在整個操作過程中都處于zuì適于修飾的單鏈狀態，大提高了修飾效率。
4．DNA包埋于包埋塊中，切換反應液非常方便，而且DNA不會丟失，所以zuì終回收率都在90%以上。
5．適用于實體材料、懸浮細胞和純化好的DNA樣品。
6．本試劑盒足夠制備150多個10μL包埋塊(如果用純化好的DNA)或25個10μL包埋塊(如果用懸浮細胞)。

試劑盒組成：

成分	規格
包埋液	1.5ml
分子生物學級石蠟油	25ml
包埋塊裂解液	12.5ml
蛋白酶K溶液(10mg/mL)	150μl
溶液A	30ml
溶液B成分一	2.3 g×5棕色瓶
溶液B成分二	110mg×5棕色管
TE緩沖液，pH8.0	125ml
說明書	1份

注: 包埋液用1.5mL旋蓋離心管包裝，溶液B成分一用5mL棕色瓶包裝，溶液B成分二用1.5mL旋蓋棕色管包裝。

儲存條件：低溫運輸、4℃保存、避免反復凍融，有效期一年。

使用方法：

一、準備試劑
1．在裝有2.3g溶液B成分一干粉的瓶中加入3.9mL水和0.9mL溶液A，搖晃溶解得到4.8mL溶液B成分一。在裝有110mg溶液B成分二干粉的離心管中加入1mL 50℃預熱的超純水，搖晃溶解，得到溶液B成分二。將0.6mL溶液B成分二加入到4.8mL溶液B成分一中，得到5.4mL溶液B，冰上放置待用。未用完的溶液B下次不得再使用。
2．每次實驗前，將裝有1.5mL包埋液離心管在沸水浴上放置數分鐘直到變成溶液，然后放80℃待用。

二、對微量組織材料(如果材料足夠，可先純化DNA，再按第三方案進行)
1．用常規的胰酶消化法處理動物實體組織或培養細胞，得到濃度不超過60細胞/μL的單細胞PBS懸液。如果實驗材料已經是單細胞懸浮液(如卵細胞)，則PBS洗滌后直接離心沉淀，再重懸在PBS中(濃度不超過60細胞/μL)。注：本試劑盒不含本步所需相關試劑。
2．在一個2mL離心管中加入3μL細胞懸液，再迅速滴加7μL在 80℃預熱的包埋液。注：不需要吹打混勻以免混合液在搶頭里面凝固。
3．加入500μL分子生物學級石蠟油，將離心管在沸冰浴中放置20分鐘。
4．將離心管轉移到冰上放置30分鐘，低溫下包埋液和細胞混合液將凝固成10μL的包埋塊。
5．加入500μL包埋塊裂解液和5μL Proteinase K溶液，37℃保溫過夜。加入的溶液比重都比石蠟油大，將會自動沉降到石蠟油下層，不需離心。
6．吸棄包埋塊之外的所有溶液(包括石蠟油)，用1mL TE緩沖液室溫浸泡包埋塊2次，每次15分鐘。此步可去除殘留包埋塊裂解液。
7．酶切包埋塊中的DNA：選定不識別PCR靶片段的內切酶(本試劑不提供該相關試劑)，再用100μL選定內切酶的1×緩沖室溫液浸泡包埋塊15分鐘，吸棄緩沖液后再加入100μL選定內切酶的1×緩沖液和50U選定的內切酶，37℃保溫2小時。
8．吸棄酶切反應液，再加入500μL新鮮配制的處理液A(配制方法：100μL溶液A+400μL超純水)室溫放置15分鐘，重復此步一次。此時DNA將呈單鏈。
9．吸棄處理液A后，用1mL新鮮配制的處理液B(注：不是溶液B，配制方法：50μL溶液A+950μL超純水)室溫浸泡包埋塊5分鐘。
10．吸棄處理液B，加入750μL石蠟油，然后沸水浴20-30秒，使DNA單鏈徹底彼此分開。
11．獎離心管轉移到冰上放置30分鐘使包埋塊重新凝固。
12．在離心管中加入1mL預冷的溶液B，溶液B將自動沉降到石蠟油下層。繼續在冰上放置30分鐘。此步用于修飾單鏈的DNA。
13．將離心管轉移到50℃放置3.5小時。
14．吸棄溶液B，用1mL TE緩沖液常溫洗滌包埋塊2次，每次15分鐘。
15．吸棄TE緩沖液，用500μL新鮮配制的處理液C(50μL溶液A+450μL超純水)常溫洗滌包埋塊2次，每次15分鐘。
16．吸棄處理液C，用1mL TE緩沖液常溫洗滌包埋塊3次，每次10分鐘.
17．吸棄TE緩沖液，所得包埋塊可以在4℃保存數月待用，也可以用超純水洗滌兩次(每次15分鐘)后直接用做100μL體系甲基化PCR的模板。

三、對純化好的DNA
18．選用不識別PCR靶片段的合適內切酶酶切純化的基因組DNA(本試劑不提供所需試劑)，總體積不超過20μL，基因組DNA不超過700 ng。
19．酶切結束后，沸水浴5-10分鐘滅活內切酶并變性DNA。
20．冰上放置并短暫離心數秒后，再加入4μL溶液A，50℃保溫15分鐘。
21．迅速加入50μL在80℃預熱的包埋液，用手指快速彈擊管底混勻溶液并繼續放80℃待用。不要吹打混勻以避免包埋液在移液槍頭中凝固。
22．在一個新的2mL離心管中，加入1mL預冷的溶液B，再加上750μL石蠟油，并將離心管放冰上預冷。
23．迅速取80℃保溫的混合液10μL，用在空中滴加的方式加到上步準備的預冷的離心管中，滴加的混合液遇冷將迅速在石蠟油中形成包埋塊并自動沉入管底，得到1個包埋塊。注意：不要將槍頭浸入到預冷的溶液中，否則包埋液將迅速在槍頭內凝固。如果包埋塊沒有沉到管底，可以用槍頭將其撥到石蠟層下面的液相中。
24．再重復上步操作6次(步驟23)，共可以得到7個包埋塊(約含100ng DNA)。
25．將離心管(含7個包埋塊)繼續放冰上30分鐘進行修飾。
26．后續操作同第13-17步。

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