3′RACE試劑盒是高品質的基因結構和功能產品，由北京百奧萊博供應，本產品僅用于生物化學研究方面，本產品質量好，且具價格，深為用戶稱道，了解更多3′RACE試劑盒等基因結構和功能產品請聯系我司咨詢訂購。...

特別提示：包括3′RACE試劑盒在內，本公司的所有產品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫療及其他非科研用途！

產品名稱：3′RACE試劑盒
英文名稱：3′-RACE Kit
產品貨號：BTN101104
產品規格：10次

研究真核基因的zuì基礎的工作之一就是確定其轉錄終止位點，目前zuì通用的方法是3′-RACE法，RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)是Frohman發明的、通過PCR快速克隆cDNA末端的技術，它在不建立cDNA文庫的前提下，利用已知cDNA序列設計引物，通過往兩端延伸和擴增獲得其3′-端序列。本試劑盒就是根據3′-RACE原理而開發。RACE的原理如下圖：


產品特點：
1. 即開即用，客戶不需要單獨準備各種材料。
2.反應條件經過精心優化，包括使用無RNase H活性的MMLV和優化的引物。

試劑盒組成：

成分	規格
MMLV逆轉錄酶-RI混合物(RNase H-，200U/μL)	10μl
MMLV Buffer(含dNTP)	50μl
PCR MagicMix 2.0(含酶和染料)	1.5ml
3′-RACE引物A(10μM)	10μl
3′-RACE引物B(10μM)	100μl
3′-RACE引物C(10μM)	100μl
RNase-Free水	1ml
說明書	1份

儲存條件：低溫運輸、-20℃保存、有效期一年。

使用方法：

一、利用含Oligo(dT)的3′-RACE引物A進行逆轉錄
 注意：MMLV酶使用前必須短暫離心，因為它含50%甘油，及其粘稠，否則將取不到所需體積。
1.在一個PCR管中，加入以下組分：

成分	用量
Poly(A)RNA(或總RNA)	0.2-2μg(5μg)
3′-RACE引物A(10μM)	1μL
MMLV Buffer(含dNTP溶液)	5μL
RNase-Free水	補至19μL
合計	19μL

 注意：如果可能，zuì好使用Poly(A)RNA作為模板。
  65℃保溫5分鐘，展開RNA的二級結構，立即冰浴待用。
2. 再在上述PCR管中加入1μl MMLV逆轉錄酶-RI混合物(200U/μL)。
3. 37℃保溫60分鐘，42℃保溫30分鐘進行逆轉錄反應；然后50℃保溫10分鐘終止反應。
4. 加入0.5mL RNase-free水稀釋上步得到的cDNA，冰浴待用。長期放置需要放-20℃保存。

二、利用基因專一性引物A和3′RACE引物B進行輪PCR
5. 用不同量的RT反應液(稀釋后的cDNA)設置PCR(樣品組zuì好設置用量梯度，單位：μL)。

成分	梯度1	梯度2	梯度3	梯度4
稀釋后的cDNA	1	5	10	15
基因專一性引物A(10μM)	2.5	2.5	2.5	2.5
3′RACE引物B(10μM)	2.5	2.5	2.5	2.5
98℃ 5分變性RNA-cDNA雜交鏈，短暫離心后再加入下列成分
PCR MagicMix 2.0	25	25	25	25
RNase-free水	19	15	10	5
合計	50	50	50	50

6. 按下列條件進行PCR(注：應根據實際情況選擇適當的退火溫度)。
 第1次循環：52-60℃ 2分，72℃ 40分(此步的目地是合成第二鏈的cDNA，復性溫度需要根據自備基因專一性引物A的Tm值進行優化，一般可以從55℃開始)。
 第2-30次循環：94℃ 1分鐘，52-60℃ 1分，72℃ 3分(此步為PCR擴增，復性溫度需要根據自備基因專一性引物A的Tm值進行優化，一般可以從55℃開始)。
 zuì后延伸：72℃ 15分
7. 取5μl的PCR反應液進行瓊脂糖凝膠電泳以確認PCR擴增產物。若得到目的擴增產物需要用于后續實驗，請于-20℃保存；若沒有得到目的擴增產物，可按下列步驟進行巢式PCR反應。

三、利用基因專一性引物B和3′RACE引物C進行巢式PCR反應
8. 將上輪PCR產物(4管)均用水稀釋稀釋20倍，然后每管均用巢式PCR進行擴增。巢式PCR反應設置如下：

成分	用量
PCR MagicMix 2.0	25μl
上步得到的PCR反應液(稀釋20倍后)	1μl
基因專一性引物B(10μm)	2.5μl
3′RACE引物C(10μm)	2.5μl
超純水	補至50μL

9. PCR反應。按下列條件進行PCR：
第1-30次循環：94℃ 1分鐘，52-60℃ 1分，72℃ 3分(復性溫度需要根據自備基因專一性引物B的Tm值進行優化，一般可以從55℃開始)zuì后延伸：72℃ 15分
10.電泳檢測。然后根據實驗結果進行DNA測序或TA克隆。

注意事項：
1. 如果兩輪PCR得到的非特異產物多，可以在RT反應是繼續降低3′-RACE引物A的用量。
2.自備的基因專一性引物的GC含量zuì好跟3′-RACE引物B和引物C的一致，后者長度均為18nt，均含11個G(或C)，7個A(或T)。

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名稱：Acetylcholinesterase/ACHE mRNA原位雜交試劑盒
貨號：ZN0013
規格：100T
基本信息：
保存條件：4℃保存一年
工作量：100張切片。
有效期：一年。
適用種屬：human,rat,mouse,rabbit
標記方式：3’—尾段標記
標記方式：3’—尾段標記
試劑盒中內容：
1.胃蛋白酶(×10; Pepsin)2ml；
2.預雜交液 2ml；
3.Acetylcholinesterase/ACHE mRNA原位雜交試劑盒寡核苷酸探針雜交液 2ml；
4.封閉液 5ml；
5.生物素化鼠抗地gāo辛 5ml；
6.SABC-POD 5ml；
7.生物素化過氧化物酶 5ml。
用戶自備試劑：
原位雜交專用蓋玻片；POLY-L-LYSINE；DEPC；20%甘油
緩沖液(3%檸檬酸,2×SSC，0.5×SSC，0.2×SSC,原位雜交用 PBS)
一．培養細胞和冰凍切片
準備工作：
固定液：4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)；1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)
3%檸檬酸——100ml蒸餾水中加檸檬酸(C6H8O7?H2O)3g,PH2.0左右。
2×SSC——1000ml蒸餾水中加氯化鈉17.6g，檸檬酸三鈉(C6H5O7Na3?2H2O，分子量294)8.8g。
0.5×SSC——300ml蒸餾水加100ml 2×SSC即可。
0.2×SSC——270ml蒸餾水加30ml 2×SSC即可。
20%甘油——20ml甘油加80ml蒸餾水即可。
原位雜交用PBS(1000ml蒸餾水加氯化鈉30g,Na2HPO4?12H2O 6g,NaH2PO4?2H2O 0.4g),PH7.2-7.6。
操作程序：
注意：zuì重要的是及時固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC處理，以抑制RNA酶對mRNA的分解作用。此外，過度固定對原位雜交有明顯的不利影響。
1．玻片的處理：一般采用多聚賴氨酸或APES。切片厚度10-20μm。
2．細胞在多聚賴氨酸處理的蓋玻片上進行培養，條件為37℃和5%的CO2，所用培養基為Dulbecco基礎培養基。細胞長好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分鐘×3次。
3．培養細胞和冰凍切片均可用下述方法固定：固定液為4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室溫固定 20--30分鐘。蒸餾水充分洗滌，干燥后-20℃冰凍可保存2周以上。
4．30%H2O2 1份+純甲醇50份混合，室溫處理30分鐘。蒸餾水洗滌3次。
5．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶(1ml 3% 檸檬酸加2滴濃縮型胃蛋白酶，混勻)，37℃或室溫消化5—120秒鐘。有時也可以不消化。原位雜交用 PBS洗3次×5分鐘。蒸餾水洗1次。
6.后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液為1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室溫固定 10分鐘。蒸餾水洗滌3次。
7．預雜交：濕盒的準備——干的雜交盒底部加20%甘油20ml以保持濕度。按每張切片20μι加預雜交液。恒溫箱38-42℃2—4小時。吸取多余液體，不洗。
8．雜交——按每張切片20μι雜交液，加在切片上。將原位雜交專用蓋玻片的保護膜揭開后，蓋在切片上。恒溫箱38-42℃雜交過夜(根據雜交情況可以調節)。
9．雜交后洗滌：揭掉蓋玻片，37℃左右水溫的2×SSC洗滌5分鐘×2次；37℃0.5×SSC洗滌15分鐘×1次; 37℃0.2×SSC洗滌15分鐘×1次(如果有非特異性染色，重復0.2×SSC洗滌15分鐘×1-2次)。
10.滴加封閉液：37℃30分鐘。甩去多余液體，不洗
11.滴加生物素化鼠抗地gāo辛：37℃ 60分鐘或室溫120分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×4次。勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌。
12.滴加SABC：37℃20分鐘或室溫30分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×3次。勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌。
13.滴加生物素化過氧化物酶：37℃20分鐘或室溫30分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×4次。
14.DAB顯色：使用DAB顯色試劑盒—1ml蒸餾水加顯色劑Ａ，Ｂ，C各一滴，混勻，加至標本上。一般顯色20-30分鐘。若無背景出現則可繼續顯色。也可自配DAB顯色劑后顯色。充分水洗。
15.必要時蘇木素復染，充分水洗。
16.酒精脫水，二甲苯透明，封片。
二．石蠟切片
如果有條件的話，應盡可能地采用新鮮標本。標本離體后，及時予以固定。固定液為4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.0-7.6)，含有1/1000 DEPC。標本較大時用刀片切成厚度不超過4mm的小塊，固定1小時即可，較大的標本固定不要超過2小時。某些組織對過度固定尤其敏感，如動物大腦，固定時間30-40分鐘，一般不要超過1小時。
1．常規脫水、浸蠟、包埋。切片厚度6-8μm。
2．玻片的處理：一般采用多聚賴氨酸或APES。
3．石蠟切片經常規脫蠟至水。30%H2O2 1份+蒸餾水10份混合,室溫5-10分鐘以滅活內源性酶。蒸餾水洗3次。
4．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶(1ml 3% 檸檬酸加2滴濃縮型胃蛋白酶，混勻)，37℃或室溫消化3--30分鐘(視標本新舊、厚薄自行調整)。用戶可以比較不同的消化時間，例如5分鐘,10分鐘，20分鐘，30分鐘。以找到zuì佳的消化時間。原位雜交用PBS洗3次×5分鐘。蒸餾水洗1次。其余步驟和冰凍切片6-16步相同。
結果觀察：
Acetylcholinesterase/ACHE的細胞胞漿著色呈棕黃色。
注意事項：
由于特定的mRNA序列僅占總mRNA的少數，加上基因僅由四個堿基排列組合而成，因此原位雜交容易出現非特異性染色。通過不加探針和用陰性標本做對照，基本可以確定染色是否為特異性的。有明顯的非特異性染色現象時，用預雜交液對含探針的雜交液進行稀釋，一般稀釋2—10倍；并應加強探針雜交后的洗滌。如果有少量的細胞核著色屬于正常情況；如果出現大量的細胞核著色，往往和標本固定時間過長有關，應重新處理標本。

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