北京百奧萊博供應的化學發光法生物素標記核酸檢測試劑用于科研目的，我公司的化學發光法生物素標記核酸檢測試劑品質上佳，經過多年的開發生產，已然非常成熟，歡迎廣大新老客戶訂購。...

特別提示：包括化學發光法生物素標記核酸檢測試劑盒在內，本公司的所有產品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫療及其他非科研用途！

產品名稱：化學發光法生物素標記核酸檢測試劑盒
英文名稱：Chemiluminescent Biotin-labeled Nucleic Acid Detection Kit
產品貨號：YT032
產品規格：1000cm2

本試劑盒是一種通過Streptavidin-HRP及后續的ECL試劑來實現化學發光檢測Biotin標記核酸的檢測試劑盒。適用于Southern blot、Northern blot、ribonuclease protection assay (RPA)或EMSA等實驗中，采用生物素標記的DNA或RNA探針時的檢測。本試劑盒不適用于生物素標記蛋白的檢測。

本試劑盒采用了高質量的Streptavidin-HRP Conjugate，HRP和Streptavidin共價交聯的比例大于3，這樣比采用Streptavidin和Biotin-HRP conjugate兩種試劑進行檢測要更方便，并且靈敏度更高。采用了非特異性結合比avidin更低的strepatavidin，使檢測結果背景更低靈敏度更高。

本試劑盒沒有提供生物素探針標記相關的試劑，生物素標記的DNA探針或EMSA探針的制備可以相應地使用百奧萊博的生物素標記DNA試劑盒（TdT加尾法）或EMSA探針生物素標記試劑盒(YT189)。本試劑盒可以用于檢測至少10塊10 x 10cm有生物素標記EMSA探針的膜，即共1000cm2。

試劑盒組份：

ECL A液	55ml
ECL B液	55ml
Streptavidin-HRP Conjugate	100μl
封閉液	380ml
洗滌液(5X)	250ml
檢測平衡液	250ml

儲存條件：-20℃。

使用說明：
1. 在使用Biotin標記探針的情況下，完成Southern、Northern雜交及后續洗滌后，或RPA的轉膜和交聯后，或EMSA的轉膜和交聯后，可以使用本試劑盒開始檢測。下面的檢測過程中溶液的用量是用于一片10x10cm膜的量。如果膜較大或較小，各溶液的用量可以按比例放大或縮小。
2. 37-50oC水浴溶解封閉液和洗滌液。
注意：封閉液和洗滌液必須完全溶解后方可使用，封閉液和洗滌液可以在室溫至50oC之間使用，但必須確保這兩種溶液中均無沉淀產生，在冬天需特別注意。
3. 取一合適的容器加入15ml封閉液，再放入交聯過的含有樣品的尼龍膜。在側擺搖床或水平搖床上緩慢搖動15分鐘。
4. 取7.5μl Streptavidin-HRP Conjugate加入到15ml封閉液中(1:2000稀釋)，混勻備用。
5. 去除封閉液，加入上一步中配制的15ml含有Streptavidin-HRP Conjugate的封閉液。在側擺搖床或水平搖床上緩慢搖動15分鐘。
6. 取25ml 洗滌液(5X)，加入100ml重蒸水或MilliQ級純水，混勻配制成125ml洗滌液。
7. 將尼龍膜轉移至另一裝有15-20ml洗滌液的容器內，漂洗1分鐘。
8. 去除洗滌液，加入15-20ml洗滌液，在側擺搖床或水平搖床緩慢上洗滌5分鐘。
9. 重復步驟8三次(共洗滌四次)，每次洗滌時間均約為5分鐘。
10. 將尼龍膜轉移至另一裝有20-25ml檢測平衡液的容器內，在側擺搖床或水平搖床上緩慢搖動5分鐘。
11. 取5ml ECL A液和5ml ECL B液混勻，配制成ECL工作液。注意：ECL工作液必須現配現用。說明：從本步驟起操作方法和注意事項同Western實驗的熒光檢測。
12. 取出尼龍膜，用吸水紙吸去過多液體。立即將膜的樣品面向上，放置到處于水平桌面上的潔凈容器內或保鮮膜上。
13. 在尼龍膜的表面小心加上步驟11配制好的共10ml ECL工作液，使工作液完全覆蓋尼龍膜。室溫放置2-3分鐘。
14. 取出尼龍膜，用吸水紙吸去過多液體。將尼龍膜放在兩片保鮮膜或其它適當的透光薄膜中間，并固定于壓片暗盒(也稱片夾)內。
15. 用X光片壓片1-5分鐘。可以先壓片1分鐘，立即顯影定影，然后根據結果再調整壓片時間；也可以直接分別壓片30秒、1、3、5分鐘或更長時間，然后一起顯影定影觀察結果。

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名稱：BLOTTO溶液
貨號：BTN100812
規格：250mL
BLOTTO全名是Bovine Lacto TransferTechnique Optimizer，是一種含有脫脂奶粉、磷酸鹽和抗菌劑的雜交阻斷劑，可以用于DNA雜交(Southern雜交、斑點雜交、菌落雜交)、Western雜交、ELISA；但不能用于RNA雜交和低拷貝的Southern雜交。也不能與含高濃度的SDS混用。

儲存條件：低溫運輸、-4℃保存(不能保存在-20℃)，有效期一年。

名稱：脫脂奶粉
貨號：BTN130907
規格：50g
本產品為分子生物學級脫脂奶粉，可廣泛用于Southern、Northern和Western印跡雜交實驗的封閉試驗。

儲存條件：常溫運輸和保存、有效期半年。

名稱：SSPE溶液，20×
貨號：BTN100809
規格：250mL
20×的SSPE含3M NaCl、0.2M NaH2PO4、0.02M Na2EDTA，pH為7.4。它是一種在核酸分子雜交中廣泛使用的溶液。其特點先是鹽濃度接近飽和，可以非常方便地稀釋到不同濃度，提供不同的雜交和洗滌嚴謹度。其次，高鹽濃度可以抑制微生物生長，便于長期放置。zuì后，它可以用于幾乎所有核酸雜交試驗。由于緩沖能力比SSC強，更適合于需要穩定pH的實驗。

儲存條件：常溫運輸及保存、有效期兩年。

名稱：超級雜交液(不含甲酰胺)
貨號：BTN8091
規格：100mL
核酸雜交一般是指用一種標記的核酸探針與印跡膜上的核酸進行雜交，由此檢測印跡膜上是否存在與探針同源的核酸分子(靶分子)。核酸雜交是分子生物學的基本技術之一，應用非常廣泛。由于核酸雜交效率受印跡膜種類、雜交溫度、探針濃度、雜交液離子強度、雜交液pH及雜交液粘度等因素影響，用戶自己摸索和優化相關條件非常繁瑣，因此本公司開發了本產品，其操作流程如下：


產品特點：
1. 既可用于Southern雜交(靶分子為DNA)，也可用于和Northern雜交(靶分子為RNA)，還可以用于菌落雜交，基因芯片等雜交。
2. 既可以用于同位素探針的雜交，也可以用于非同位素探針的雜交。
3. 既可以使用DNA(包括DNA Oligo)探針，也可以使用RNA探針(包括RNA Oligo)
4.含多種能夠促進雜交的聚合物，使雜交反應能在6～12小時完成，而常規雜交反應一般需要12～24小時。
5.含多種封堵劑，能阻印跡膜對探針分子的非特異性吸附，能有效降低背景信號，延長曝光時間以便檢測到低拷貝的RNA(Northern)和單拷貝的基因(Southern)。
6. A型不含甲酰胺，B型含50%的甲酰胺。后者使雜交在較低溫度就可以完成，適合Tm 較高的分子雜交(如RNA-RNA和RNA-DNA雜交)。
7.跟各種常用的印跡膜兼容，包括硝酸纖維素膜和尼龍膜。

儲存條件：低溫運輸，-20℃保存，有效期一年。本產品屬于高鹽溶液，低溫下產生沉淀，必須在65℃加熱溶解并充分搖勻后才能使用。

使用方法：

一、根據探針和靶分子的不同，分別按下面不同情況計算雜交分子的Tm 值
1. 對DNA-DNA雜交，其Tm = 81.5 + 16.6×log10[Na+] + 0.41×GC%–500/L
說明：L是探針或靶分子的長度(用兩者中zuì短的一個)
GC%是探針或靶分子中的GC 百分比(用兩者中zuì短的一個)
Na+濃度是本產品中Na+的濃度，為0.75 M，16.6 ×log10[Na+]=(-2.07)
2. 對DNA-RNA雜交，其Tm 值比DNA-DNA的Tm 值要高10-15℃。
3. 對RNA-RNA雜交，其Tm 值比DNA-DNA的Tm 值要高20-25℃。
4. 對Oligo探針雜交，Tm=GC 數量×4℃+AT 數量×2℃。

二、確定zuì佳雜交溫度(預雜交溫度跟雜交溫度應該一樣)
1. 對于大于200bp的DNA-DNA雜交，zuì佳雜交溫度一般比Tm低15-25℃，一般選擇68℃。
2. 對RNA-RNA或DNA-RNA雜交，zuì佳雜交溫度一般比Tm低15-25℃。如果這樣計算出的雜交溫度很高(如高于70℃)，則RNA容易降解，所以zuì好選用含甲酰胺的超級雜交液(B型本產品)，以便能在42℃完成雜交。
3. 對Oligo探針的雜交，zuì佳雜交溫度一般比Tm低5℃。由于Oligo較短，更容易受各種因素影響(如錯配率、修飾堿基比例等)，所以zuì佳溫度需要適度摸索和優化。

三、確定洗膜溫度
一般使用0.1×SSC做洗膜液，在此條件下的zuì佳洗膜溫度比Tm低5-12℃，一般情況下可以在55℃進行洗膜。Oligo探針可以室溫洗膜。

四、預雜交步驟
預雜交就是用不含探針的本產品跟印跡膜進行孵育，其目的是用所含的非特異性DNA分子(鮭精DNA或小牛胸腺DNA)及其它高分子化合物將印跡膜上會非特異地吸附探針分子的位點封閉，否則這些位點會吸附標記的探針，造成高背景。
1. 將結合了靶分子的硝酸纖維素印跡膜或尼龍印跡膜浸泡于自備的6×SSC溶液中，使其充分濕潤。
2. 將濕潤的印跡膜置于一塑料雜交袋中(塑料袋zuì好預先封口，再剪掉一角，留一個小口)，按每平方厘米印跡膜加0.2mL超級雜交液的比例沿小口加入超級雜交液，然后用塑料封口機將口封牢。
3. 將此塑料袋浸沒入溫度設定在zuì佳雜交溫度的恒溫水浴中或雜交爐中，保溫1-2小時，延長到12-16小時亦可。注意保溫過程中塑料袋應在不停的搖動狀態中，使超級雜交液與印跡膜充分接觸。

五、雜交步驟
1. 如果標記的探針是雙鏈核酸，則需經變性處理。具體操作是將探針樣品在沸水浴中加熱5分鐘，然后迅速置冰浴中。如果是單鏈DNA或RNA探針，則不需變性，直接使用。
2. 將單鏈探針或變性后的雙鏈探針加入到完成了預雜交的雜交袋中(先用剪刀剪一小口，加入探針后用熱封機封口)。探針的加入量視探針標記效率而定，一般要求終濃度不能低于1-2 ng/mL。如果檢測基因組中的單拷貝基因，探針的加入量應加大，而對于檢測克隆的基因片段，則探針的量可減少。如果是放射性探針，應將此塑料袋套在另一塑料袋之中，以避免雜交袋發生遺漏、污染工作環境。
3.在選定的雜交溫度下繼續保溫，時間一般為6-12小時。

六、洗膜步驟。注意在下面的所有操作過程中，一定不要使印跡膜干燥。
此步是將與印跡膜非特異結合的探針分子洗去而只留下特異結合的探針分子。由于非特異性雜交的雜交分子解鏈溫度較低，熱穩定性較差，在一定的溫度和較低的離子強度下，即可洗掉。
1.雜交完畢，取出塑料袋，剪去一角，倒出所有的含探針的雜交液。此含探針的雜交液可以多次使用再倒棄。
2. 剪開雜交袋，用鑷子取出印跡膜，浸沒于大量的2×SSC(含0.5%SDS)溶液中，室溫下振蕩漂洗15分鐘。
3. 重復上步操作一次。
4. 將印跡膜轉移至0.1×SSC(含0.1% SDS)溶液中，在計算好的洗膜溫度下振蕩漂洗30分鐘至1小時。
5. 重復上步操作一次。如果是同位素標記探針，則需要重復至用蓋革計數器在無核酸區域檢測不出放射信號為止。
6. 將印跡膜轉移到濾紙上，吸去表面液體后印跡膜即可用于后續檢測。

疑難解答：
問題一：高背景(有或沒有雜交信號)
解決方案：將放射性探針的比活降低到2×10E6 cpm/mL以下；將非放射性探針的終濃度降低到30 ng/mL以下；將探針長度控制在200–800 核苷酸；減少雜交時間；適當提高雜交溫度。
問題二：沒有雜交信號或雜交信號非常弱
解決方案：雜交過程中應應該連續振蕩，不應該有氣泡，避免印跡膜變干。將放射性探針活性提高到>5×10E8 cpm/ng，提高非放射性標記探針的終濃度；適當降低雜交溫度。

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