大孔吸附樹脂HPD600(層析)是高品質的分離試劑類產品，由北京百奧萊博供應，本產品用于科研試驗，大孔吸附樹脂HPD600(層析)是我司眾多優質分離試劑類之一，質量堪比同類進口產品，價格非常優惠，目前正熱烈促銷中，恭候您的咨詢訂購。...

特別提示：包括大孔吸附樹脂HPD600在內，本公司的所有產品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫療及其他非科研用途！

產品名稱：大孔吸附樹脂HPD600
英文名稱：HPD600
產品貨號：Y14789
產品規格：500g

儲存條件：RT
外觀：顆粒
用途：層析

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名稱：鎳-瓊脂糖凝膠6FF
貨號：QN4044
規格：5ml|10ml|25ml|100ml
Ni-NTA瓊脂糖凝膠6FF是用于純化6×His標簽重組蛋白的一種純化介質，它是由6%交聯的Sepharose耦連了一種四齒螯合劑NTA而得.它可用于在非變性或變性條件下純化任何表達系統表達的6×His標簽重組蛋白。NTA，含有四個螯合區，較一般的三齒螯合劑能更好的結合Ni2+。6×His可與Ni2+螯合，從而使His標簽蛋白結合在Ni-NTA純化介質上，未結合的蛋白被洗滌下去，結合在介質上的蛋白經過一定濃度的咪唑或低pH緩沖液的溫和洗脫下來，從而得到高純度的目的蛋白。該純化介質與His標簽蛋白具有高的親和力，可達5-20mg/ml。可在非變性和變性條件下純化任何表達系統所得的His標簽蛋白。純化程序簡單，所得的蛋白純度可高達95％。Ni-NTA可再生4-6次，重復使用。本產品懸浮液為20％乙醇，已螯合Ni2+。操作方法：

別名：鎳-瓊脂糖凝膠6FF鎳瓊脂糖凝膠鎳柱
儲存條件：4℃保存，有效期至少一年

A.非變性條件下抽提His標簽蛋白

1)準備細胞，接種，誘導表達。收集細胞，置于-70℃或立即進行步驟2操作。

2)加入1/20細胞生長體積的NTA-0 Buffer和PMSF。PMSF使用的工作濃度為1mM現用現加。

3)將細胞懸浮起來，加入溶菌酶，混勻，冰上放置30分鐘，超聲或勻漿破碎細胞。該步驟冰上操作。

4)加入10% Triton X-100,使終濃度為0.05%，充分混勻，冰上放置15分鐘。

5)12000 rpm/min(20,000×g以上)，4℃離心15分鐘以上。取上清，置于冰上備用或-20℃保存。

6)將NTA樹脂裝入合適的層析柱，層析用10倍NTA體積的NTA-0 Buffer洗。

7)將樣品加至NTA層析柱中，流速在15ml/h左右，收集穿透部分，用SDS/PAGE分析蛋白的結合情況。

8)層析用5倍NTA體積的NTA-0 Buffer洗，流速控制在30 ml/h左右。

9)分別用5倍NTA體積的NTA-20、NTA-40、NTA-60、NTA-80、NTA-100、NTA-200、NTA-1000 Buffer洗脫，流速控制在15ml/h左右，收集洗脫液，每管收集一個NTA體積。

10)確定目標蛋白質在洗脫液中的分布情況。zuì為有效的方式是SDS-PAGE分析。也可以用Bradford蛋白質測定試劑盒，快速確定蛋白質的含量，然后用SDS/PAGE分析蛋白質的分布。

11)純化的目標蛋白質的保存條件需要根據蛋白質的性質和用途確定。NTA-0、20、40、60、80、100、200、1000Buffer分別為濃度20 mM Tris-HCl pH7.9,0.5M NaCl,10% Glycerol，添加0、20、40、60、80、100、200、1000 mM Imidazole。

B.變性條件下從包涵體中純化His標簽蛋白

1)準備細胞，接種，誘導表達。收集細胞，置于-70℃或立即進行步驟2操作。

2)加入1/20細胞生長體積的GuNTA-0 Buffer和PMSF。PMSF使用的工作濃度為1mM現用現加。

3)將細胞懸浮起來，冰上超聲破碎細胞，降低粘稠度。

4)室溫放置30分鐘，間或混勻或用磁力攪拌。

5)12000轉/分（20,000×g以上），4℃離心15分鐘以上。取上清，置于冰上備用或-20℃保存。

6)將NTA樹脂裝入合適的層析柱，層析用10倍NTA體積的GuNTA-0 Buffer洗。

7)將樣品加到NTA層析柱中，流速控制在15ml/h左右，收集穿透部分，用于SDS/PAGE分析蛋白質的結合情況。

8)層析用5倍NTA體積的GuNTA-0 Buffer洗，流速控制在30 ml/h左右。

9)分別用5倍NTA體積GuNTA-20、GuNTA-40，GuNTA-60、GuNTA-100、GuNTA-500洗脫，流速在15ml/h左右，收集洗脫液，每管收集一個NTA體積。

10)確定目標蛋白質在洗脫液中的分布情況。zuì為有效的方式是SDS/PAGE分析。也可以用Bradford蛋白質測定試劑盒，快速確定蛋白質的含量，然后用SDS/PAGE分析蛋白質的分布。

11)目標蛋白質需要進一步純化需要根據蛋白質的用途確定。

12)純化的目標蛋白質需要復性，復性常用的手段可以參考有關手冊確定的原則。

GuNTA-0、20、40、60、100、500Buffer分別為濃度20 mM Tris-HCl pH7.9,0.5M NaCl,10% Glycerol,6 M Guanidium HCl添加0、20、40、60、100、500 mM Imidazole。

C.NTA樹脂的再生

NTA樹脂在使用若干次數（3-5次）后，結合效率有所下降，可以用以下方法再生，提高樹脂的使用壽命和蛋白質的結合效率。

NTA樹脂再生前需要從層析柱下端流干所有溶液，估計出NTA的樹脂體積，按下列次序將再生試劑加到層析柱里，在等上一步再生溶液流干后，再加下一步再生溶解。

用戶需要自行準備25%、50%、75%、（v/v）乙醇和去離子水。從層析柱下端流干所有溶液，用2倍NTA樹脂體積的Stripping Solution I、2倍體積的去離子水、3倍體積的Stripping Solution II、1倍體積的25%乙醇、1倍體積的50%乙醇、1倍體積的75%乙醇、5倍體積的乙醇、1倍體積的75%乙醇、1倍體積的50%乙醇、1倍體積的25%乙醇、1倍體積的去離子水、5倍體積的Stripping Solution III、3倍體積的去離子水分別洗一遍。

如果立即使用，用5倍體積的Ni Charging Solution洗，再用10倍體積的平衡溶液（NTA-0Buffer或GuNTA-0 Buffer）洗；如果想長期儲存，加入1倍體積的20%乙醇，4℃保存，使用前用5倍體積的Ni Charging Solution洗，再用10倍體積的平衡溶液（NTA-0Buffer或GuNTA-0 Buffer）洗

再生溶液配方：Stripping Solution I:  6M GuHCl,0.2M acetic acid。Stripping Solution II: 2% SDS。        Stripping Solution III: 100 mM EDTA,pH 8.0。Ni Charging Solution: 100 mM NiSO4

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