北京百奧萊博供應的隨機引物法DNA探針地高xīn標記試用于科研試驗，本產品質量好，且具價格，深為用戶稱道，了解更多隨機引物法DNA探針地高xīn標記試等探針標記及檢測產品請聯系我司咨詢訂購。...

特別提示：包括隨機引物法DNA探針dì高辛標記試劑盒在內，本公司的所有產品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫療及其他非科研用途！

產品名稱：隨機引物法DNA探針dì高辛標記試劑盒
英文名稱：Random Primer DNA Labeling Kit(Digoxin)
產品貨號：BTN90603C
產品規格：5次

本試劑盒是基于Feinberg和Vogelstein發明的隨機引物標記法而開發出來的即用型DNA探針標記試劑盒，標記過程由雙鏈DNA熱變性、隨機引物與單鏈DNA結合、在Klenow DNA聚合酶催化下，引物的延伸合成DNA探針并摻入標記的核苷酸三步組成，可用下面的示意圖表示：

本產品對Feinberg和Vogelstein經典方法進行了改良。

產品特點：
1. 提供的標記反應液整合了除酶和模板外的所有成分，簡化了反應加樣步驟，提高了標記反應的可重復性。
2. 使用無外切活性的Klenow exo- DNA聚合酶，已標記DNA探針不會被酶降解。
3.快速，zuì快1小時即可完成標記反應。
4. 得到的DNA探針比活性高(如果是同位素，可以達到109cpm/μg DNA)，檢測靈敏度高。
5. 所需模版DNA量少(只需要10ng以上即可)，DNA可以是各種形狀(線狀和環狀)的、也可以是單鏈或雙鏈的，長度在100bp以上均可。
6. 得到的探針長度在200-400nt之間，可以用于Southern雜交、Northern雜交、原位雜交、菌落和斑點印跡雜交等。
7. 提供三種標記選擇，其中BTN90603A可用于各種同位素標記和其他任何非同位素標記，但需自備標記底物；BTN90603B和BTN90603C可分別用于生物素和dì高辛標記，不需自備標記底物。

試劑盒組成：

成分	規格
2×A型標記反應液(自備標記物型)	50μl(僅A型有)
2×B型標記反應液(生物素型)	50μl(僅B型有)
2×C型標記反應液(DIG型)	50μl(僅C型有)
dATP,2mM	10μL(僅A型有)
dTTP,2mM	10μL(僅A型有)
dGTP,2mM	10μL(僅A型有)
dCTP,2mM	10μL(僅A型有)
Klenow exo-聚合酶(2U/μL)	5μl
超純水	1ml
說明書	1份

儲存條件：低溫運輸，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：
1.在一干凈的硅化的塑料離心管中加入下列成分：

成分	用量
模板DNA	50-150ng
2×標記反應液(ABC三種之一)	10μl
超純水	補水到15μl

注意：非同位素標記物由于疏水性強，容易與常用的塑料離心管表面非特異性結合，所以一定要使用硅化的塑料離心管。模板DNA并非越多越好，因為模板會在雜交反應中跟標記的探針雜交，競爭性地抑制探針跟靶分子的雜交。
2. 沸水浴5-10分鐘，或在PCR儀上100℃加熱5-10分鐘使DNA模版充分變性，立即放冰上待用。注意：如果PCR儀器不能設置到100℃，99℃加熱5分鐘也可。
3.高速離心數秒使所有液體集中在管底，根據試劑盒類型加入下列成份：

試劑盒類型	成分及用量
BTN90603A型	dATP、dGTP、dCTP各1μl(共3μL，濃度均為2mM) 自備的2mM dTTP/標記dUTP混合物(見注)1μL 1μl Klenow exo聚合酶
BTN90603B型	1μl Klenow exo聚合酶 4μl超純水
BTN90603C型	1μl Klenow exo聚合酶 4μl超純水

注：上表中的dTTP/標記dUTP混合物中dTTP和標記的dUTP的總濃度為2mM(在20μL體系中混合液的終濃度為0.1mM，dTTP與生物素或DIG標記的dUTP的比例zuì好為65:35)。由于空間阻礙，并非標記生物素或DIG標記的dUTP越多靈敏度越高，一般dTTP與標記dUTP的比例在65：35為zuì佳。但如果使用自備的其他標記核苷酸，如fluorescein、hydroxycoumarin、resorufin和aminoallyl標記的dUTP，則用戶需要自己摸索其與dTTP之間的zuì佳比例，如果使用32P標記的dUTP，則比活zuì好為3000Ci/mmol，濃度為好為10uCi/μL，并且不需要加入dTTP。
4. 輕柔吹打混勻。如有液滴沾在管壁上，高速離心數秒使所有液體集中在管底。
5. 37℃保溫1-20小時。標記效率跟模版量和保溫時間相關，具體見下表：

模版DNA用量	1小時后探針合成量	20小時后探針合成量
10ng	80ng	900ng
30ng	150ng	1.35μg
100ng	350ng	1.65μg
300ng	750ng	2.2μg
1μg	1.3μg	2.6μg
3μg	1.6μng	2.6μg

6. 加1μl自備的0.5M EDTA(pH8.0)終止反應，立即放冰上待用或放-20℃保存一年。用前需要加熱100℃ 5分鐘使DNA探針變性成單鏈，然后直接加入到雜交反應液中即可。如果電泳檢測，標記產物將是彌散狀態。
 注意：本方法標記核苷酸摻入率高，因此可以不經純化直接使用。如果需要純化，注意不要用酚抽提法純化非同位素(生物素、DIG和其他等)標記的DNA探針，因為這些標記分子疏水性強，能使標記的DNA進入疏水的有機相而丟失，但可以用乙醇沉淀和Sephadex G50回收(可另購非同位素探針柱式純化試劑盒)。對比活高的同位素探針，由于其其不穩定，因此應該立即使用，不要長久放置。

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名稱：5′末端同位素標記試劑盒
貨號：BTN131036
規格：20次
本產品為DNA 5′末端標記系統，利用T4 Polynucleotide Kinase(T4多聚核苷酸激酶)和［γ-32P］ATP 對粘性末端或平末端的DNA或RNA的5′末端進行標記反應。原理如下：


產品特點：
1. 使用本試劑盒之前，不需要對 5′末端的磷酸基團進行去磷酸化處理，因為使用的kinase 能使5′末端的磷酸與[γ-32P]ATP的γ-磷酸進行交換。
2. 合成的單鏈或雙寡核苷酸的5′末端游離的OH基團都能通過Kinase反應被標記(或者只是簡單的磷酸化)。
3. 提供的兩種反應液使交換反應和磷酸化反應都能進行，均能得到大于106 cpm/pmol(5′-end)的比活性。

試劑盒組份：

成分	規格
T4 多聚核苷酸激酶(10U/μL)	20μl
5×交換反應緩沖液	100μl
10×磷酸緩沖液	50μl
Control DNA	20μl
說明書	1份

儲存條件：低溫運輸，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：

一、交換反應
1. 實驗前需自備的試劑：7 M 醋酸銨、乙醇、70%乙醇等
2.在微量離心管中制備下列反應液：

成分	加入的體積
自備的5′磷酸化DNA片段	14μL(≤5 pmoles的5′末端)
5×交換反應緩沖液	5μL
[γ-32P]ATP	5μL
T4 多聚核苷酸激酶(10U/μL)	1μL
滅菌的超純水	補足到25μL

注：5 pmoles的5′末端約等于0.17μg的長100bp的雙鏈DNA。
3. 37℃反應30分鐘。
4. 70℃加熱5～10分鐘使酶失活。
5. 加入10μl的7 M CH3COONH4(pH4.5)。如使用CH3COONa做乙醇沉淀時使其終濃度達300mM。
6. 加入87.5μl(2.5倍)的冷無水乙醇，-20℃放置30～60分鐘。
7.離心回收沉淀，用 70%的冷乙醇清洗沉淀，真空干燥。
8. 用適當 Buffer 溶解沉淀。
注：通過第5～8 步操作幾乎可以除去大部分未反應的[γ-32P] ATP，如要完全將其除去時，乙醇沉淀后用凝膠過濾等方法精制即可。如需用苯酚抽提除去蛋白質時，請在第8 步之后進行。

二、磷酸化反應標記

A. 去磷酸化反應
1. 實驗前需自備的試劑：TE 飽和酚/lǜ仿、3 M NaCl 、乙醇、70%乙醇、牛小腸堿性磷酸酶(CIAP)等
2.在微量離心管中制備下列反應液：

成分	加入的體積
自備的DNA片段	133μL(≤10μg)
1M Tris-HCl，pH8.0	15μL
牛小腸堿性磷酸酶(CIAP，10～20U/μL)	2μl
滅菌的超純水	補足到150μL

3. 50℃反應30分鐘。
4. 加入150μl的TE 飽和酚/lǜ仿/異戊醇(25：24：1)，充分混勻。
5.離心，取上層(水層)移到另一個微量離心管中。
6. 重復操作 4～5。
7. 加入7.5μl的3 M NaCl(zuì終濃度150mM)。
8. 加入375μl(2.5倍量)的冷無水乙醇，-20℃放置30～60分鐘。
9.離心回收沉淀，用 1mL 70%的冷乙醇清洗后，沉淀真空干燥。
10. 使用 20μl的TE Buffer 溶解沉淀。

B. 磷酸化反應(前反應)
1.在微量離心管中制備下列反應液：

成分	加入的體積
自備的DNA片段	20.5μL(≤5 pmoles的5′末端)
10×磷酸緩沖液	2.5μL
[γ-32P]ATP	1μL
T4 多聚核苷酸激酶(10U/μL)	1μL
滅菌的超純水	補足到25μL

2. 37℃反應30分鐘。
3.下面的操作與交換反應的第4-8 步操作相同。

三、合成DNA 寡核苷酸的標記
1.在微量離心管中制備下列反應液：

成分	加入的體積
Oligonucleotide DNA with free 5′-OH(5～10 pmoles)	≤3μL
10×磷酸緩沖液	2.5μL
[γ-32P]ATP	1μL
T4 多聚核苷酸激酶(10U/μL)	1μL
滅菌的超純水	補足到25μL

2. 37℃反應30分鐘。
3.下面的操作與交換反應的第4-8 步操作相同。

四、合成DNA 寡核苷酸的標記
當摻入水平很低的時候，需要使用本步驟，即通過體積排阻色譜或過濾試劑盒除去未反應的標記。Sephadex G-50 層析柱(需另購)對于去除未摻入的dNTPs效果很好，它還能大幅減少小于20個堿基的DNA 寡核苷酸和小于20bp的雙鏈DNA的量。使用之前需要在70℃加熱5～10分鐘以使T4 多聚核苷酸激酶失活。Sephadex G-25 層析柱可以用來純化長度不小于10個堿基的寡核苷酸。

注意事項：
1.緩沖液可在室溫融解。融解后立即置于冰中，使用前充分混勻。
2. 5×交換反應緩沖液于-20℃凍結保存時會有白色渾濁出現，但不影響反應效果。
3.酶切得到的DNA片段需經乙醇沉淀等方法純化。
4. 當用于交換反應的DNA在5 pmoles以上(約1,000bp以上)時，標記效率有時會低于106 cpm/pmol。
5. 如果交換反應所用 DNA低于500bp時，標記效率有時會有所降低。
6. 若不進行放射線標記，僅使用本試劑盒做5′末端磷酸化反應時，反應體系中的［γ-32P］ATP可用5μl的10mM ATP 代替。
7. 磷酸化反應時的［γ-32P］ATP可用［γ-35S］ATP 替代。

使用舉例：
按照使用方法中交換反應和合成DNA 寡核苷酸的標記的實驗操作，取λ-BstP I，λ-Hpa I，λ-EcoT22 I 各3 pmols，用［γ-32 P］ATP 通過正向磷酸化反應或交換反應標記。各DNA片段的放射自顯影結果如下所示：


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