線粒體膜通透性轉換孔檢測試劑盒由北京百奧萊博供貨并提供相關技術服務支持，本品用于生化實驗研究等領域，本品質量穩定，價位合理，需要線粒體膜通透性轉換孔檢測試劑盒等探針標記及檢測產品的客戶，請到我公司官網聯系我們。...

特別提示：包括線粒體膜通透性轉換孔檢測試劑盒(流式分析)在內，本公司的所有產品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫療及其他非科研用途！

產品名稱：線粒體膜通透性轉換孔檢測試劑盒(流式分析)
英文名稱：Mitochondrial Permeability Transition Pore Assay Kit ( flow cytometry)
產品貨號：SY0583
產品規格：100T

線粒體膜通透性轉換孔，又稱線粒體巨型通道（magachannel），是存在于線粒體內外膜之間的非選擇性高導電性通道，由多種蛋白質復合組成。線粒體通透性轉換孔 (mPTP)可能參與了細胞死亡過程中線粒體成分的釋放。

正常的細胞線粒體內膜可維持正常的線粒體電位梯度以保證細胞呼吸作用及能量供應，隨著Ca2+的攝入和釋放，一種低電導滲透性轉換孔在張開和閉合中來回切換。當細胞發生凋亡時和病理性死亡時，線粒體膜電位轉換孔滲透性發生改變，Ca2+的過載，線粒體谷胱甘肽的氧化，活性氧水平的升高，包括后繼細胞色素C的釋放，線粒體膜電位下降等都會導致線粒體滲透性轉換孔的激活。

線粒體膜通透性轉換孔檢測試劑盒（流式分析）檢測方法是一種相對于僅基于線粒體膜電位分析更直接的檢測線粒體通透性轉換孔開放的檢測方法。其原理是：先通過被動運輸加載Calcein AM，后者是一種對活細胞進行熒光標記的細胞染色試劑，能夠輕易穿透活細胞膜，被細胞內的酯酶剪切形成膜非滲透性的性分子 Calcein，從而被滯留在細胞內，使胞質包括線粒體發出強綠色熒光。加入CoCl2后，來自胞質的熒光被CoCl2淬滅，僅留下線粒體內的熒光。作為對照，可將細胞加載Calcein AM和CoCl2的同時，對其用離子霉素處理，從而使細胞加載更多的Ca2+，引起線粒體通透性轉換孔的激活從而使線粒體熒光淬滅。

本試劑盒以1ml標記體系計算，可供100次檢測。檢測zuì大激發波長494nm，zuì大發射波長517nm。

產品組份：
Calcein AM———————5×50μg
DMSO——————————250μl
CoCl2(80mM)——————1.2ml
Ionomycin(100μM)————750μl
Cell Stain Buffer———2×250ml

儲存條件：-20℃避光干燥，避免反復凍融，有效期至少6個月

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名稱：PCR法DNA探針生物素標記試劑盒
貨號：BTN90604B
規格：5次
PCR標記的原理是用帶標記的dNTP進行PCR，zuì后得到的PCR產物將帶有標記，可以直接用于雜交試驗。其原理示意圖如下：


產品特點：
1.一站式，本試劑盒提供經過優化的試劑，不需要用戶自己摸索。
2. 足夠10次50μl體系的常規PCR(用于制備標記反應的模板和設置對照反應)和5次50μl體系的標記反應。
3.一次標記可以得到μg級的雙鏈DNA探針或約700ng的單鏈DNA探針，足夠多次雜交實驗用。
4. 既可用于制備雙鏈探針，也可以用于單鏈探針。
5. 90604A需自備含標記核苷酸的dNTP，90604B和90604C分別含生物素和dì高辛標記的底物。自備的標記包括fluorescein-dUTP、hydroxycoumarin-dUTP、resorufin-dUTP和aminoallyl-dUTP等。
6. 本產品得到的探針參入率一般為4-5%(每100個核苷酸中有4-5個將帶有非同位素標記)，有效降低了空間阻礙，檢測效果zuì佳。
7.可以用于Southern和Northern Blot、原位雜交、菌落和斑點印跡雜交等分析。

試劑盒組成：

成分	規格
2×標記專用PCR Mix	500μl
dNTP，2mM each	50μl
含Biotin-11-dUTP的dNTP	25μL(僅B有)
含DIG-11-dUTP的dNTP	25μL(僅C有)
超純水	1ml
說明書	1份

注：標記專用PCR Mix不含dNTP。

儲存條件：低溫運輸，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：

一：準備工作
1. 按常規的方法設計PCR引物，使探針長度在400-800bp之間。過短則標記參入少，探針雜交信號強度減弱；過長則非特異雜交增加，背景變強。
2. 根據PCR引物優化PCR條件。
3. 由于標記的dNTP比較珍貴，所以本試劑盒不推薦以基因組DNA或其他復雜DNA為模板直接進行PCR標記，而是建議采取下述的兩步法標記來提高成功率，即先制備非標記PCR產物，再以之為模板制備標記的PCR產物。
二：非標記PCR產物的制備
4. 設置50μL PCR的反應體系：

成份	用量
2×標記專用PCR Mix	25μl
dNTP，2mM each	5μl
自備的探針引物一(10pmol/μL)	1μL(10μM)
自備的探針引物二(10pmol/μL)	1μL(10μM)
自備的模板DNA	1μg基因組DNA或1ng質粒DNA
超純水	補到50μL

5. 按已經優化的PCR參數進行PCR。
6.電泳檢測和膠回收所需的PCR產物，并定量。用10 pmol引物一般能得到1μg左右的PCR產物(具體取決于PCR產物的長度)。注意：zuì好采取膠回收而不是PCR回收以避免殘留引物干擾后續的標記PCR。
三：標記PCR反應(zuì好做一個不加標記的對照用于定量)
說明：在設置下面反應時，如果加一種引物，就得到單鏈標記的PCR產物；如果加兩種引物，則得到雙鏈標記的PCR產物。由于雙鏈PCR探針在雜交前雖然要變性成單鏈后使用，但雜交時變性的雙鏈彼此還會復性，這種復性會與探針-靶DNA雜交反應相競爭，降低雜交效率，因此強烈推薦使用單鏈標記的DNA探針。

成份	樣品	對照
2×標記專用PCR Mix	25μl	25μl
含Biotin-11-dUTP的dNTP或 含DIG-11-dUTP的dNTP或 自備的含其他標記dUTP的dNTP	5μl	不加
dNTP，2mM	不加	5μl
雙鏈標記：探針引物一和引物二 單鏈標記：探針引物一或引物二	每種50 pmol 一種50 pmol	每種50 pmol 一種50 pmol
上步膠純化所得PCR產物 (單鏈標記可用100ng)	10 ng	10 ng
超純水	補到50μL	補到50μL

 注意：本試劑盒提供的dNTP混合物中，標記底物與非標記底物的比例已經進過優化，如果自備標記dUTP，其與dTTP的zuì佳比例需要優化，標記不同，比例不同。對DIG-11-dUTP，zuì佳比例1：3；對BrdUTP，zuì佳比例為1：1。
7. 按第5步的PCR參數進行標記PCR，但需要進行下列修改：一是循環數增加到35-55個循環。由于模板為純化后的PCR產物，探針對擴增長度完整性要求不高(長度不均的探針由于能形成網絡結構，效果反而更好)，所以可以增加循環數；二是延伸時間增加15秒，因為標記dUTP參入到DNA的速度比常規的dTTP慢；三是降低復性溫度5-7℃，因為標記核苷酸參入到DNA后，新模板的Tm值將降低。
8. 標記探針的定量：取標記反應和對照反應的產物1-5μl，在瓊脂糖凝膠上跟濃度已知的DNA marker一起電泳，并判斷探針的濃度。由于標記反應的PCR產物中額外帶有非同位素的配體(生物素，dì高辛等)、因此其泳動速度將慢于非標記PCR產物(但同位素標記不能用此法)。
 注意：如果擴增的是單鏈DNA探針，其結合EB的能力遠低于雙鏈DNA(EB是嵌合到雙鏈堿基對之間的，而單鏈DNA沒有堿基對，只有一些局部區域折疊形成的有限雙鏈區，因此能結合的EB很少)，因此EB染色的強弱不能準確反應DNA的濃度，可以采用銀染定量(跟marker比較)。一般100ng模板按上述條件經過單鏈PCR擴增可得到700ng左右探針。
9. 剩余的PCR標記產物可以不經過純化，直接加入(對單鏈PCR探針)雜或加熱變性并急冷后加入(對雙鏈PCR探針)到雜交液中使用。如果暫時不用請放-20℃長期保存。如果需要純化，請使用乙酸銨/乙醇沉淀法。

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