一站式miRNA尿素-PAGE電泳套裝由北京百奧萊博供貨并提供相關技術服務支持，本品僅用于生物化學研究方面，我公司專注于核酸電泳和回收產品的研發、生產和供應，為您提供的一站式miRNA尿素-PAGE電泳套裝質量可靠，批間差小，且價格公道，熱切盼望您選購我們的產品。...

特別提示：包括一站式miRNA尿素-PAGE電泳套裝在內，本公司的所有產品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫療及其他非科研用途！

產品名稱：一站式miRNA尿素-PAGE電泳套裝
英文名稱：One-Stop miRNA Urea-PAGE Pack
產品貨號：BTN70606
產品規格：30次

尿素-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Urea PAGE)是目前分離200nt以下的小片段RNA，尤其是20nt左右的microRNA(miRNA)分子的主要方法，但是單獨配制各種溶液十分繁瑣，為此我們公司開發了本產品。

產品特點：
1.一站式，含有電泳所需要的所有試劑，即開即用，十分方便，免去了實驗人員稱取有毒物品。
2. 靈活，可以根據需要配制各種濃度的Urea-PAGE，以便對長度各異的RNA進行電泳。
3.電泳后可直接用于UV觀察、銀染、膠回收、Northern雜交和放射自顯影等。
4. 使用緩沖液，可以防止甘油的干擾。

產品組成：

成分	規格
尿素	210g
丙烯酰胺	60g
甲叉雙丙烯酰胺	3g
TBE電泳液，10×	250ml
TEMED	1.5ml
過硫酸銨(干粉)	1g
miRNAload	10ml
miRNA Marker	30次
固相RNase清除劑	100ml
說明書	1份

儲存條件：常溫運輸、4℃保存(miRNAload、miRNA Marker需要-20℃保存)。保存期為一年。

使用方法：

一、準備工作
1. 用固相RNase清除劑清潔工作的臺面和器皿(詳見該產品的使用手冊)。
2. 配制1 X電泳緩沖液：將適量的10X電泳緩沖液用RNase-free水稀釋10倍，得到1X電泳緩沖液待用。
3. 配制10%過硫酸銨溶液：稱取約100mg過硫酸銨到一干凈的1.5mL離心管中，按每1mg過硫酸銨加10μl RNase-free水的比例加入RNase-free水，搖晃致溶，立即使用。注意：放置時間不要超過一周。

二、配制凝膠
1. 估計所需要的凝膠溶液的體積，一般配制一塊13cm×15cm×0.8mm的膠需要15mL凝膠溶液，配制一塊36cm×45cm×0.8 mm的膠需要120mL凝膠溶液。
2. 根據所需要的凝膠溶液的體積，在一的干凈的三角瓶中按下表加入各成分(此處以配制100mL濃度為15%的凝膠為例):

成分	終濃度	用量
尿素	7M	42g
40% Acrylamide/Bis溶液	15%	37.5mL
10×電泳緩沖液	1×	10ml
補RNase-free水到100mL

注：Acrylamide/Bis的終濃度需要根據待分離RNA長度選擇(見下表)。

需分離的RNA長度范圍	Acrylamide/Bis工作濃度
6-100nt	20%
25-150nt	15%
40-200nt	12%
60-400nt	8%
80-500nt	5%
1000-2000nt	3.5%

3. 攪拌并加熱到40-50℃左右，直到尿素完全溶解。
4. 冷卻到室溫后，將三角瓶接上真空系統抽真空處理10-15分鐘以充分去除溶液中的氧氣(氧氣會降低聚合反應效率)。但如果實驗條件有限，此步也可以省略。
5. 邊搖晃溶液變加入50μl TEMED和500μl 10%過硫酸銨。注意：即使選擇其他工作濃度的Acrylamide/Bis，TEMED和10%過硫酸銨的用量也不需要隨之改變。但如果配置的凝膠溶液的體積變化，TEMED和10%過硫酸銨的用量也要按比例改變。
6. 再充分搖晃約30秒后迅速灌膠，然后插入樣品梳。
7.室溫放置30-60分鐘使膠凝固。
8. 將凝膠板放置在電泳裝置上后，在上下層分別加入適當量的1×電泳緩沖液。如果不馬上使用，需要有濕紙將上樣孔端蓋住以防凝膠過度干燥。
9. 拔出梳子后用加樣槍吸取電泳緩沖液，充分將每個加樣空中未聚合的Acrylamide/Bis、尿素和氣泡吹打出來。

三、電泳
1.在上樣前，預電泳 20-30分鐘以使多余的過硫酸銨跑出加樣空，同時還可以使凝膠的溫度升高(到 50℃左右)，有利于RNA電泳時維持在變性狀態。預電泳電流見下面第 5 條。
2. 將miRNA樣品與等體積的miRNAload 混合，70℃保溫 2-3分鐘后迅速放置在冰上冷卻，快速離心半分鐘，放冰上待用。
3. 關電泳儀后開始上樣。注意：每次上樣后如果不更換槍頭，則需要充分吹打洗凈槍頭以防樣品的交叉污染。
4. 同時上樣 miRNA Marker。
5. 重開電泳儀，對 13cm×15 cm的膠，以20-30mA的電流電泳，直到紅色染料移動到凝膠邊緣為止；對 36cm×45cm的膠，則以50-60mA的電流電泳，直到紅色染料移動到凝膠邊緣為止。

四、后續處理
1.染色觀察：將凝膠一面的玻璃板揭開，直接用仍然附著在另一玻璃板上的凝膠進行各種染色，包括銀染(固定、漂洗、顯影和定影等步驟)、EB(每100mL 1×TBE中加 20μL 10mg/mL的EB溶液)、我們公司低毒核酸染料 DNAgreen(每100mL 1×TBE中加10μL DNAgreen 原液)。UV下觀察并拍照。
2. miRNA回收：按上法用EB等染料染色后，UV下確定所需要的miRNA條帶的位置，切膠后進行膠回收處理。
3. Northern雜交：按上法用EB等染料染色后，UV下確定所需要的miRNA條帶的位置，切膠后電轉移到帶正電的尼龍膜上，然后進行雜交處理。
4. 放射自顯影：如果miRNA樣品電泳前經過同位素標記，則將凝膠一面的玻璃板揭開，用濾紙將附著在另一玻璃板上的凝膠吸附過來，然后包上保鮮膜，真空抽干，然后使膠跟X光片向對置進行放射自顯影。

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名稱：一站式DNA非變性PAGE電泳套裝
貨號：BTN100205
規格：30次
本品就是專門用于非變性PAGE的試劑。非變性PAGE電泳是研究SSCP-PCR(single-strand conformation polymorphism-PCR、單鏈PCR片段構象多態性)和凝膠滯阻(Gel Shift)的重要研究手段，因為在非變性PAGE中，DNA的遷移率除跟長短相關外，還跟其構象和結合的蛋白質相關。

產品特點：
1.一站式，用戶只需要準備水和樣品，十分方便。
2. 安全，免去了實驗人員接觸粉末狀的劇毒物品丙烯酰胺。
3. 靈活，高濃度的丙烯酰胺溶液可用于配制各種濃度的PAGE膠，分開提供的丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺可用于配制各種交聯度的PAGE膠。
4. PAGE電泳后可直接用于銀染等后續試驗。

產品組成：

成分	規格	保存
丙烯酰胺	60g	室溫
甲叉雙丙烯酰胺	2g	室溫
TEMED	1.5ml	4℃，避光
過硫酸銨(干粉)	1g	室溫
非變性PAGE上樣液，2×	1ml	4℃
10×TBE(BTN90313)	250ml	室溫
說明書	1份

儲存條件：常溫運輸，保存條件見上表，有效期一年。

使用方法：
用于SSCP-PCR分析的非變性PAGE電泳(其他應用請相應修改參數)

一、PAGE濃度的選擇：zuì好使用濃度為5-12%的丙烯酰胺膠，因為SSCP-PCR的擴增長度一般在150-200bp之間，而5%的PAGE的有效分辨范圍為80-500bp、8%的PAGE的有效分辨范圍為60-400bp、12%的PAGE的有效分辨范圍為40-200bp。

二、PAGE交聯度的選擇：交聯度越低，孔徑越大，對DNA分子構象的變化越靈敏，SSCP分辨率越高，但過低則膠太軟，不好進行電泳后的后續操作，所以一般選擇1-2%的交聯度(即丙烯酰胺：甲叉雙丙烯酰胺在49:1到48:2之間)。

三、體積的選擇：SSCP-PCR檢測需要長約30-40cm的測序膠板，可以結合梳子的厚度，計算膠的體積。
操作：
1. 配制PAGE膠(這是配制100mL膠的用量，配制更大體積的膠則需以此用量為基礎按比例增加)
A：新鮮配制10%的APS(過硫酸銨)：按每0.1克過硫酸銨干粉加1mL超純水的比例將水加到裝有硫酸銨干粉的1.5mL EP管中，搖晃到粉末全部溶解。配制好的10%的APS溶液可以在4℃存放一周。
B：新鮮配制適當交聯度29:1的30%的丙烯酰胺-甲叉雙丙烯酰胺溶液(AB溶液，下同)：在本產品提供的裝有60 g丙烯酰胺干粉的塑料瓶中加入146mL自備的去離子水和全部的甲叉雙丙烯酰胺，充分搖晃直到溶解(約需10-20分鐘)，即得到30%的AB(29:1)溶液。此溶液zuì好在一個月內用完，必須4℃避光保存。
C：配SSCP PAGE膠：在一個250mL的三角瓶中，先按下表的用量加入去離子水、30% AB溶液溶液和10×TBE緩沖液。丙烯酰胺單體溶液具有神經毒性，一定要戴手套操作。

PAGE膠濃度	各成分用量(單位：ml)			總體積(ml)
	去離子水	30%AB溶液	10×TBE緩沖液
5%	73.4	16.6	10.0	100
6%	70.0	20.0	10.0	100
7%	66.7	23.3	10.0	100
8%	63.3	26.7	10.0	100
9%	60.0	30.0	10.0	100
10%	56.7	33.3	10.0	100
11%	53.3	36.7	10.0	100
12%	50.0	40.0	10.0	100

注：有大量文獻報道PAGE膠中加入5%-10%的甘油能提高某些位點的分辨率。如果選擇加入10%的甘油，則減少去離子水的用量10mL，同時加入10mL甘油。
D：搖晃混勻。zuì好能抽真空10-15分鐘以去除溶液中的氧氣(氧氣能抑制丙烯酰胺聚合反應)，無條件也可以不脫氧。
E：加入500μL 10%APS和100μL TEMED，迅速搖勻后倒膠。
F:在膠的液面距離達到頂部時停止灌膠，插入梳子。
G:室溫聚合30-60分鐘(低溫抑制聚合反應)。
H: 拔出梳子，用1×TEB液沖洗加樣孔。
I: 放4℃冰箱預冷30分鐘-12小時。為了防止膠收縮，zuì好頂部加少量1×TBE緩沖液。預冷的膠有利于保持單鏈DNA的構型。
2. 將預冷的凝膠板固定在電泳裝置上，往上槽和下槽中加入足夠1×TEB電泳液。
3. 取3-5μl SSCP-PCR樣品，加入等體積2×非變性PAGE上樣液，85℃處理5分鐘后冰浴。用前短暫離心后取2μl上樣。
4.連接電源線，打開電源開關。如果PAGE中不含甘油，則使用25W的功率，電泳5-7小時(對3—40cm長的PAGE膠而言)。如果使用含甘油的PAGE，則使用8W的功率，電泳16-18小時。由于溫度變化過大會改變DNA構型，所以電泳時zuì好能保持恒溫。對不含甘油的PAGE，zuì好恒溫在4℃、對含甘油的PAGE，zuì好恒溫在25℃。
5. 終止電泳，取出凝膠進行后續的處理(如銀染)。

疑難解答：
一、為何SSCP-PCR帶型有復合條帶？
原因之一：可能是殘留的PCR引物跟單鏈的DNA結合形成遷移率不同的條帶。解決方法是稀釋PCR或電泳前將PCR產物進行純化。
原因之二：可能是PCR產物用量過高，彼此復性。解決辦法是將PCR產物稀釋后4-8倍后使用。
二、如何提高電泳分辨率？
可以在配膠時加入甘油(終濃度為5%-10%)，因為甘油是弱變性劑，能部分展開DNA折疊結構，增加表面積，增加電泳時位移差異。但加入甘油后粘性變大，電泳速度變慢，因此只適合室溫電泳使用，不要4℃電泳。如果條件允許，zuì好同時做加甘油和不加甘油的電泳實驗。

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