BL21(DE3)pLysS感受態細胞是高品質的克隆與表達產品，由北京百奧萊博供應，本產品用于科研試驗，本產品質量好，且具價格，深為用戶稱道，了解更多BL21(DE3)pLysS感受態細胞等克隆與表達產品請聯系我司咨詢訂購。...

特別提示：包括BL21(DE3)pLysS感受態細胞在內，本公司的所有產品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫療及其他非科研用途！

產品名稱：BL21(DE3)pLysS感受態細胞
英文名稱：BL21(DE3)pLysS Competent Cell
產品貨號：WE0254
產品規格：100μl×10支

  本產品是大腸桿菌BL21(DE3)pLysS菌株經特殊工藝處理得到的感受態細胞，可用于DNA的熱擊轉化。該菌株攜帶pLysS質粒，具有氯霉素抗性，適合表達毒性蛋白和非毒性蛋白。PLysS含有表達T7溶菌酶的基因，能夠降低目的基因的背景表達水平，但不干擾目的蛋白的表達。使用pUC19質粒檢測，轉化效率可達107。

產品組成：

組份	0.1ml×10支
BL21(DE3)pLysS Competent Cell	10×100μl
Control DNA pUC19，0.1ng/μl	10μl

實驗前準備及重要注意事項
1、感受態細胞一定要用干冰運輸。感受態細胞應在-80℃下保存，不可反復凍融和放置時間過長，以免降低感受態細胞的轉化效率。
2、轉化所有步驟均在無菌條件下操作。
3、包裝中有0.1ng/μl的pUC19DNA，供對照試驗使用。

使用方法：
1、取感受態細胞置于冰浴中。一次轉化感受態細胞的建議用量為50-100μl，可以根據實際情況分裝使用。以下實驗以50μl感受態細胞為例。
2、待感受態細胞融化后，向感受態細胞懸液中加入目的DNA(根據實際情況加入適量的DNA，通常100μl感受態細胞能夠被1ng超螺旋質粒DNA所飽和)，用移液器輕輕吹打混勻，冰浴30分鐘。
3、42℃熱擊45秒，迅速將離心管轉移到冰浴中，冰上靜置2-3分鐘。
4、向每個離心管中加入450μl無菌的SOC或LB培養基(不含抗生素)，混勻后置于37℃搖床，150 rpm振蕩培養45分鐘使菌體復蘇。
5、根據實驗需求，取適量已轉化的感受態細胞，加到含相應抗生素的SOC或LB固體瓊脂培養基上，用無菌的涂布棒將細胞均勻涂開，將平板置于37℃直至液體被吸收，倒置培養，37℃培養12-16小時。
注意：
1)涂布用量可根據具體實驗調整。若轉化的DNA總量較多，可取少量轉化產物涂布平板；若轉化的DNA總量較少，可取200-300μl轉化產物涂布平板。若預計的克隆數較少，可通過離心(4000rpm，2分鐘)后吸除部分培養液，懸浮菌體后將其涂布于平板中。
2)新制備的固體培養基不易涂干，可將平板正置于37℃直至液體被吸收后再倒置培養。
3)涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的轉化菌落數過少，可以將剩下的菌液再涂布新培養基進行培養。

儲存條件：-80℃。

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名稱：單細胞懸浮液
貨號：BTN130805
規格：1mL
本產品是單細胞懸浮溶液，本產品與后續各種單細胞分析實驗、單細胞擴增實驗兼容。

儲存條件：低溫運輸，4℃保存，有效期一年。

名稱：pUCm-T載體
貨號：BTN160101
規格：1μg
本產品是一種克隆PCR產物(TA Cloning)的專用載體。本載體由pUC系列載體改造而成，在pUC載體的多克隆位點處插入特殊的限制性內切酶識別位點，酶切后能在載體的3′端形成懸掛的“T”末端。很多DNA聚合酶在進行PCR擴增時會在PCR產物雙鏈DNA 每條鏈的3′端加上一個突出的堿基A。這樣，pUCm-T載體的兩端就可以和PCR產物的兩端進行正確的AT 配對，在連接酶的催化下，就可以把PCR產物連接到，pUCm-T載體中，形成含有目的片斷的重組載體。可以通過藍白斑篩選有插入片斷的重組克隆，大大提高了3′末端A 突出PCR產物的連接、克隆效率。本產品應用于進行TA 克隆，克隆PCR產物。對克隆后的PCR產物可以用M13通用引物進行DNA 測序。

儲存條件：低溫運輸，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：

一. 實驗準備
1. PCR產物3′末端帶有突出的A堿基：Taq、Tth、Ampli Taq、Klen Taq DNA聚合酶擴增的PCR產物3′末端均帶有突出的A堿基。建議擴增的PCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行回收，再進行連接轉化實驗。
2. PCR產物3′末端沒有突出的A堿基：Pfu、Pwo、Tli或DeepVent等DNA聚合酶具有3′5′外切酶活性，其擴增的PCR產物末端可能不帶有3′A，要對這種平末端PCR產物進行克隆，應先對其進行3′末端加A，再進行連接轉化實驗。

二.連接反應
3.在一個標準的10mL連接反應體系中，加入下列成分：

反應組分	10μl反應體系
插入的目的片段	xμL(0.2 pmol)
本產品	1μL(50 ng)
10×連接酶緩沖液	1μL
T4 DNA連接酶	3-5 U
補水到	10 L

 注意:一般zuì后加入T4 DNA連接酶。
4. 用移液器吹打反應混合液使之混勻后，16-23℃連接1～12小時(或按T4 DNA連接酶供貨商提供的操作手冊進行連接)。

三．細菌轉化和鑒定
5. 將100μl感受態細胞置于冰上解凍后，完全解凍后輕輕將細胞均勻懸浮。
6. 加入上述5μl連接液，輕輕混勻，冰上放置30分鐘。
7. 42℃水浴熱激90秒，再冰上放置15～20分鐘。
8. 加入400μl自備的SOC培養基，37℃ 200～250rpm振蕩培養1小時。
9. 4000rpm離心5分鐘，用槍頭吸掉400μl上清液，用剩余的培養基將細胞懸浮。
10. 將細菌懸液均勻涂布在含20μl的IPTG(100mM)和100μl的X-gal(20mg/mL)的氨芐青霉素抗性的自備的LB平板上。(涂布菌液的用量可以根據連接的效率及感受態細胞的轉化效率而進行適當的調整。)
11. 將平板于37℃培養1小時，然后倒置培養過夜。(先將平板正向放置1小時，以吸收過多的液體。)

四．篩選
12.轉化子的藍白篩選：
 當外源DNA片段插入到pUCm-T載體中后，由于外源DNA的核酸序列存在改變了LacZ基因的編碼，從而影響了其產物β-半乳糖苷酶α-片段的活性，因此重組克隆在-gal/IPTG 平板上呈現為白色，而非重組克隆呈藍色。選擇在IPTG/X-gal 平板上生長的白色菌落，用牙簽挑至含氨芐青霉素的液體培養基，37℃培養過夜。
13.轉化子的鑒定：
1)用上述培養的白色菌落的菌液抽提質粒，用PstI單酶切或用其它合適的酶切,瓊脂糖凝膠電泳檢查片段大小，確定是否含有目的片段。
2)用M13通用引物或其它合適的引物直接進行測序來確定是否含有目的克隆。

操作提示：
1. PCR產物的純度：
 連接反應前需用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR反應產物，如果電泳檢測PCR產物條帶彌散，或出現非特異條帶，則需要切下目的條帶，用膠回收試劑盒對目的片段進行回收。若PCR產物電泳檢測只有預期大小的明顯條帶，也應使用PCR產物純化試劑盒直接純化PCR產物，以除去引物二聚體。不經純化的PCR產物在某些條件下可直接用于連接，但由于引物二聚體和PCR產物中其它物質的影響，造成含有插入片段的陽性克隆數減少，因而需要篩選很多克隆方可得到含有目的PCR產物的陽性克隆。
2. 平端PCR產物
 具有校正活性的熱穩定性DNA聚合酶如Pfu、Pwo、Tli在進行PCR擴增時產生平端PCR產物。這種平端PCR產物可以進行3′末端加A 尾后連接到pUCm-T載體中，采用這種方法進行連接，可大大提高克隆的效率。
3.優化插入片段和載體的摩爾比
1)pUCm-T載體優化的插入DNA片段和載體的摩爾比為3:1，采用3-10:1的連接比例也可成功進行連接。如果你的PCR產物開始連接的不理想，則有必要優化連接比例。
2)PCR產物的量可采用以下公式進行換算：
PCR片段的量(ng)= [加入載體的量(ng)×插入片段大小(kb)/載體大小(kb)]×插入片段和載體的摩爾比
4.篩選含插入片段的轉化子
插入片段成功克隆到pUCm-T載體中，可阻斷β-半乳糖苷酶的編碼序列，因而重組克隆可在指示培養基上通過顏色進行篩選。大多數情況下含有PCR產物的克隆菌為白色，如果PCR片段和LacZ基因在同一讀碼框內，即PCR片段堿基數是3的整數倍(含3′-A)，并且讀碼框無終止密碼子，則重組克隆菌可能為藍色。

質粒圖譜：


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